一种血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，包括如下试剂：浓度为0.1~1 mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液；浓度为0.5~5μg/mL的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液；浓度为0.2~1μg/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液。本发明专利技术通过对试剂盒的组成及各试剂配置工艺等与血清学抗体反应原理相关的各种关键技术的优化，使得本试剂盒的灵敏度和准确性高，最低检测限低（0.54μg/L），精密度高（日内变异系数为2.61~7%，日间变异系数为3.39~8.7%），干扰小，稳定性高。

A chemiluminescent quantitative detection kit for serum tryptase and its preparation and detection methods

Chemiluminescence quantitative detection kit of the invention relates to a serum tryptase, which comprises the following reagents: concentration of 0.1~1 mg/mL streptavidin nano magnetic particle suspension labeled; biological concentration of 0.5~5 g/mL labeled mouse anti human tryptase antibody solution; concentration of alkaline phosphatase labeled 0.2~1 g/mL the mouse anti human tryptase antibody solution. The present invention based on Optimization kit and reagent configuration technology and serology reaction principle of various related key technologies, the kit with high sensitivity and accuracy, low detection limit (0.54 g/L), high precision (intra day variation coefficient was 2.61~7%, coefficient of variation was 3.39~8.7% day) small interference, high stability.

【技术实现步骤摘要】
一种血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法
本专利技术属于医疗器械体外诊断试剂化学发光免疫分析领域，特别是涉及一种血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
类胰蛋白酶是主要由肥大细胞(MC)分泌的一种炎症介质，具有多重生物活性效应，可启动多种疾病反应的进程，并与其发生和发展有关。在很多肥大细胞相关疾病中，血清类胰蛋白酶都伴随肥大细胞的脱颗粒过程而升高。类胰蛋白酶在cDNA和蛋白水平被分为三类：α、β、γ，其中β含量最高。每个类胰蛋白酶基因均含有6个外显子和5个内含子，编码30个氨基酸的前导链和245个氨基酸的活性部位。通过氨基酸序列推断，α-类胰蛋白酶和β-类胰蛋白酶有90％的同源性。其主要区别在于β-类胰蛋白酶的-3位和215位氨基酸分别为精氨酸和甘氨酸，而α-类胰蛋白酶则分别为谷氨酰胺和天冬氨酸，两者的结构区别决定了它们活性差异。MC是机体速发性过敏反应的主要效应细胞，机体致敏时MC释放β-类胰蛋白酶于血液中，其在血液中浓度1h后达到高峰,半衰期为2h。这使得机体致敏数小时后仍能对β-类胰蛋白酶进行检测。通过ELISA法实验检测发现，正常人血液中只能检测到α-类胰蛋白酶，而β-类胰蛋白酶几乎检测不到。但对哮喘病人和过敏性鼻炎病人的支气管灌洗液、过敏性眼炎患者的泪水及风湿病患者的关节滑液及系统性过敏反应患者的血清中进行检测发现β-类胰蛋白酶含量显著升高。检测此类疾病时总类胰蛋白酶血清水平的变化，有望为疾病的临床诊断和治疗提供重要的依据。化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其他相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。化学发光免疫测定是目前世界公认先进的标记免疫测定技术，化学发光免疫分析技术具有高度的准确度和特异性，成为检验方法中最为重要的技术之一。化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的低丰度物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高且最低检测限低的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒。本专利技术所要解决的另一技术问题是提供上述试剂盒的制备方法。本专利技术所要解决的再一技术问题是提供采用上述试剂盒进行检测的检测方法。为解决以上技术问题，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术的一个目的是一种血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，包括如下试剂：浓度为0.1～1mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液；浓度为0.5～5μg/mL的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液；浓度为0.2～1μg/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液。优选地，所述的鼠抗人类胰蛋白酶抗体与所述的生物素的投料摩尔比为1:5～1:20；进一步优选为1：18～1：20。优选地，所述的碱性磷酸酶与所述的鼠抗人类胰蛋白酶抗体的投料摩尔比为2:1～10:1；进一步优选为9：1～10：1。优选地，所述的生物素为Sulfo-NHS-Biotin、NHS-LC-Biotin或NHS-LC-LC-Biotin。优选地，所述的试剂盒还包括类胰蛋白酶校准品和类胰蛋白酶质控品。进一步优选地，所述的类胰蛋白酶校准品包括浓度为0.9～1.1μg/L、4.5～5.5μg/L、11.25～13.75μg/L、45～55μg/L、180～220μg/L的类胰蛋白酶溶液；所述的类胰蛋白酶质控品包括浓度为4～6μg/L、40～60μg/L的类胰蛋白酶溶液。本专利技术中，所述的类胰蛋白酶校准品除了上述5个浓度以外，根据需要还可以包括多个其他浓度。本专利技术的另一个目的是提供一种所述的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，所述的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液的制备方法为：将鼠抗人类胰蛋白酶抗体加入到溶解有生物素的二甲基亚砜中，15～40℃下混合反应50～70min，再用0.009～0.011mol/L、pH为7.3～7.5的磷酸盐缓冲液进行透析制得所述的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液；所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备方法为：将链霉亲和素标记的纳米磁微粒经磁分离器沉淀出来后，用0.009～0.011mol/L、pH为7.3～7.5的磷酸盐缓冲液进行多次清洗，然后将清洗后的链霉亲和素标记的纳米磁微粒复溶于0.009～0.011mol/L、pH为7.3～7.5的磷酸盐缓冲液制得所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液；所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液的制备方法为：将浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液与鼠抗人类胰蛋白酶抗体按摩尔比为2：1～10：1进行混合后并纯化，得到碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体，再用0.045～0.055mol/L、pH值为5.5～6.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液对碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体稀释制得所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液。优选地，所述的碱性磷酸酶溶液的浓度为1.0～1.5mg/mL。优选地，所述的制备方法还包括类胰蛋白酶校准品的制备和类胰蛋白酶质控品的制备，所述的类胰蛋白酶校准品通过将类胰蛋白酶蛋白与0.09～0.11mol/L、pH为7.3～7.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液进行配置得到，所述的类胰蛋白酶质控品通过将类胰蛋白酶蛋白与0.09～0.11mol/L、pH为7.3～7.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液进行配置得到。本专利技术的第三个目的是提供一种所述的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)、将18～22μL的待测血清样本和类胰蛋白酶质控品分别与所述的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液、所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液在36～38℃下共孵育15～30min得到第一溶液；步骤(2)、对所述的第一溶液进行多次清洗得到第二溶液，所述的清洗方法为将所述的第一溶液在磁场的作用下静置1～3min，弃去上清液后加入清洗液；步骤(3)、向所述的第二溶液中加入所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液在36～38℃下孵育15～30min得到第三溶液；步骤(4)、对所述的第三溶液进行多次清洗得到第四溶液，所述的清洗方法为将所述的第三溶液在磁场的作用下静置1～3min，弃去上清液后加入清洗液；步骤(5)、向所述的第四溶液中加入酶促化学发光底物并测定发光强度；步骤(6)、利用类胰蛋白酶校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤(5)测定的发光强度对照所述的发光强度标准曲线，计算出所述的待测血清样本中类胰蛋白酶的含量；其中，所述的待测血清样本或所述的类胰蛋白酶质控品、所述的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液、所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液、所述的酶促化学发光底物的投料体积比为1：0.9～1.1：2.25～2.75：6～7.5：9～11。优选地，所述的检测方法在全自动化学发光仪BioCLIA系列上进行，采用所述的全自动化学发光仪BioCLIA系列进行所述的检测的具体步骤为：步骤(1)、将所述的生物素标记的鼠抗人本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：浓度为0.1~1 mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液；浓度为0.5~5μg/mL的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液；浓度为0.2~1μg/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液。

【技术特征摘要】
1.一种血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：浓度为0.1~1mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液；浓度为0.5~5μg/mL的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液；浓度为0.2~1μg/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液。2.根据权利要求1所述的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的鼠抗人类胰蛋白酶抗体与所述的生物素的投料摩尔比为1:5~1:20；所述的碱性磷酸酶与所述的鼠抗人类胰蛋白酶抗体的投料摩尔比为2:1~10:1。3.根据权利要求1所述的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的生物素为Sulfo-NHS-Biotin、NHS-LC-Biotin或NHS-LC-LC-Biotin。4.根据权利要求1所述的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括类胰蛋白酶校准品和类胰蛋白酶质控品。5.根据权利要求4所述的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的类胰蛋白酶校准品包括浓度为0.9~1.1μg/L、4.5~5.5μg/L、11.25~13.75μg/L、45~55μg/L、180~220μg/L的类胰蛋白酶溶液；所述的类胰蛋白酶质控品包括浓度为4~6μg/L、40~60μg/L的类胰蛋白酶溶液。6.一种如权利要求1至5中任一项所述的血清类胰蛋白酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液的制备方法为：将鼠抗人类胰蛋白酶抗体加入到溶解有生物素的二甲基亚砜中，15~40℃下混合反应50~70min，再用0.009~0.011mol/L、pH为7.3~7.5的磷酸盐缓冲液进行透析制得所述的生物素标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液；所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备方法为：将链霉亲和素标记的纳米磁微粒经磁分离器沉淀出来后，用0.009~0.011mol/L、pH为7.3~7.5的磷酸盐缓冲液进行多次清洗，然后将清洗后的链霉亲和素标记的纳米磁微粒复溶于0.009~0.011mol/L、pH为7.3~7.5的磷酸盐缓冲液制得所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液；所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液的制备方法为：将浓度为1.0~5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液与鼠抗人类胰蛋白酶抗体按摩尔比为2：1~10：1进行混合后并纯化，得到碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体，再用0.045~0.055mol/L、pH值为5.5~6.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液对碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体稀释制得所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人类胰蛋白酶抗体溶液。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的制备方法还包括类胰蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：李庆春，何晓静，钱林，陶艳茹，
申请(专利权)人：江苏浩欧博生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32