非人动物表现出上运动神经元功能和下运动神经元功能以及感知减弱制造技术

本发明专利技术提供了一种用于疾病如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)中运动神经元功能紊乱的动物模型，包括经基因修饰的非人动物，所述经基因修饰的非人动物包含经基因修饰的DR6等位基因并在出生时及出生后若干周或月内表现出正常表型。但是，随着所述非人动物变老，其患有表现为一种或多种ALS样症状的运动神经元功能紊乱，这在发病后可快速发展。还提供了鉴定可用于预防、延迟或治疗ALS的候选试剂的方法。

Nonhuman animals show the function of upper motor neurons and the function of lower motor neurons and the weakening of perception.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】非人动物表现出上运动神经元功能和下运动神经元功能以及感知减弱相关申请的交叉引用本申请要求美国临时申请序列号62/133,909(2015年3月16日提交)以及62/250,229(2015年11月3日提交)的权益，每个申请均据此以引用方式并入本文中。序列表通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为2016-03-16-T0041WO01-SEQ-LIST_ST25.txt，创建日期为2016年3月16日，文件大小为约685千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
本申请整体涉及随时间推移上运动神经元、下运动神经元和/或感知发育减弱的非人动物，所述动物可为神经退行性障碍(例如运动神经元疾病诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS))提供可用模型。
技术介绍
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)(也称为卢伽雷氏病)是一种由于破坏负责随意运动的脊髓、脑干和皮质中运动神经元造成的致命的神经退行性疾病。这种疾病临床上表现为进行性肌无力和肌萎缩，在疾病发作3-5年内引起麻痹和死亡。在美国大约20,000人患有ALS，并且每年新增5,000例ALS患者。ALS在世界范围内十分常见，影响所有种族和民族群体。ALS的平均发病年龄在40岁和60岁之间，但年轻人和老年男女也可患有ALS。在90％-95％的ALS病例中，该疾病是明显随机发生的(称为偶发性ALS(sALS))。在这类SALS病例中，不存在家族病史和明确相关的风险因素。在5％-10％的ALS病例中，存在遗传性基因联系(称为家族性ALS(fALS))。在与ALS相关的突变中，长期以来认为在铜-锌过氧化物歧化酶(SOD1)基因中的那些突变通过毒性功能获得而非SOD1酶的抗氧化功能受损来引发ALS疾病。带有与fALS相关突变的其它基因包括alsin(ALS2)、senataxin(ALS4)、囊泡相关膜蛋白(VAPB、ALS8)、血管生成素以及动力蛋白激活蛋白的p150亚基(DCTN1)。近来，在具有或不具有明显家族史的ALS患者中已经鉴定出Tardbp的TDP-43-编码区中的三十多种突变，这些突变对应于大约4％的fALS和小于1％的sALS。多数带有TDP-43突变的患者具有经典的ALS表型但无认知缺陷，这表明TDP-43在ALS发展中的重要作用。另外，C9ORF72基因的启动子中的GGGGCC六核苷酸扩展重复序列似乎为fALS和sALS以及ALS相关的额颞叶痴呆(ALS-FTD)的非常常见的起因。已经建立了用于ALS疾病的若干小鼠模型，这些模型包括下列品系：具有SOD1、TDP43或FUS突变的啮齿动物、ALS2-敲除小鼠以及具有经基因工程改造的编码神经丝亚单位的基因的小鼠。在这些模型中，人突变体SOD1(mSOD1)转基因小鼠模型是目前最常用的一种，因为它与ALS患者共有若干种临床表型。mSOD1小鼠的第一症状为在大约90至100日龄时出现的一个或多个肢体的轻微“抖动/震颤”。在后期阶段，小鼠开始表现出临床症状，首先表现出肌无力和/或后肢麻痹，然后轻瘫上升至前肢，最后出现严重四肢麻痹。然而，现有动物模型均不适用于人类疾病，因为动物并不表现上运动神经元症状、TDP43和/或SOD1聚集和/或非运动神经元损失。因此，需要更接近地反映人类ALS的动物模型。
技术实现思路
本文提供了一种经基因修饰的非人动物，其患有症状为上运动神经元、下运动神经元和/或感知功能紊乱的病症，因此可用作影响运动神经元的一种或多种神经退行性疾病(诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、原发性脊髓侧索硬化症、原发性脊髓侧索硬化症、进行性肌营养障碍等)的模型。具体地讲，本文提供了一种包含经修饰的内源性DR6基因座的啮齿动物(例如大鼠或小鼠)，其中经修饰的DR6基因座缺少(例如，不包含、不存在等)编码整个DR6胞质死亡结构域或DR6胞质结构域的第一核苷酸(例如，第一DNA、第一cDNA、第一基因组DNA等)序列，例如经修饰的DR6基因座缺少编码DR6胞质死亡结构域或DR6胞质结构域的任何部分的核苷酸序列。经修饰的DR6基因座还可缺少(i)编码整个DR6跨膜结构域的第二核苷酸(例如，第二cDNA、第二DNA、第二基因组DNA)序列，例如编码DR6跨膜结构域的任何部分的第二核苷酸序列；(ii)编码DR6胞外结构域或其任何部分的第三核苷酸(例如，第三cDNA、第三DNA、第三基因组DNA)序列，例如编码DR6胞外结构域的任何部分的第三核苷酸序列；(iii)第四核苷酸序列，例如从内源性啮齿动物DR6基因的整个外显子3横跨至整个外显子6(包括居间内含子)的第四基因组序列；和/或(iv)第五核苷酸序列，例如从内源性啮齿动物DR6基因的外显子2的一部分(例如碱基4103)横跨至整个外显子6例如终止密码子(包括居间内含子)的第四基因组序列，其中第五核苷酸序列编码全长和成熟内源性啮齿动物DR6蛋白。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠，并且经修饰的DR6等位基因缺少编码DR6胞质死亡结构域的第一核苷酸序列，例如经修饰的DR6等位基因缺少编码SEQIDNO:15的第388-454位氨基酸或其任何部分的第一核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了一种包含经修饰的DR6等位基因的小鼠，所述等位基因缺少编码胞质结构域(例如具有如SEQIDNO:15的第330-614位氨基酸所示的氨基酸序列的胞质结构域)的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供的小鼠包含经修饰的DR6等位基因，所述等位基因缺少编码成熟DR6蛋白的核苷酸序列，例如，如SEQIDNO:15的第1-614位氨基酸所示。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于5kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于10kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于20kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于30kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于40kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于50kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，啮齿动物对经修饰的DR6基因座为杂合或纯合的，所述基因座缺少编码内源性DR6胞外结构域、内源性跨膜结构域和/或内源性DR6胞质结构域的任何部分的核苷酸序列。如本文提供的经基因修饰的啮齿动物可例如在内源性DR6基因座(例如，如本文所述的经修饰的内源性DR6基因座)处表达核酸，例如该核酸可随机插入啮齿动物的基因组或可操作地连接至内源性DR6转录调控序列，其中该核酸编码包含功能性DR6信号肽(例如，功能性异源DR6信号肽、功能性内源性DR6信号肽、功能性大鼠DR6信号肽、功能性小鼠DR6信号肽等)、跨膜结构域(例如，DR6跨膜结构域或异源跨膜结构域(例如，ROR1跨膜结构域))、报告基因蛋白(例如，β-半乳糖苷酶蛋白)或其组合的多肽，并且其中多肽缺少(例如，未可操作地融合至、不包含等)功能性DR6胞质结构域或其任何部分。在一些实施方案中，多肽也缺少功能性DR6胞外结构域或其任本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经基因工程改造的啮齿动物，在其基因组中包含经修饰的内源性DR6基因座，所述经修饰的内源性DR6基因座缺少编码整个DR6蛋白的胞质结构域的第一核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.16 US 62/133,909;2015.11.03 US 62/250,2291.一种经基因工程改造的啮齿动物，在其基因组中包含经修饰的内源性DR6基因座，所述经修饰的内源性DR6基因座缺少编码整个DR6蛋白的胞质结构域的第一核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的经基因工程改造的啮齿动物，其中所述经修饰的内源性DR6基因座还缺少编码整个成熟DR6蛋白的第二核苷酸序列。3.根据权利要求1或权利要求2所述的经基因工程改造的啮齿动物，其中所述经修饰的内源性DR6基因座包含编码功能性DR6信号肽的核酸序列，所述功能性DR6信号肽可操作地融合至跨膜结构域和报告基因蛋白中的至少一者。4.根据权利要求3所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述核酸序列编码可操作地融合至所述跨膜结构域的所述功能性DR6信号肽，并且其中所述跨膜结构域可操作地融合至所述报告基因蛋白。5.根据权利要求3或权利要求4所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述功能性DR6信号肽为内源性DR6信号肽。6.根据权利要求3至5中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述跨膜结构域不是内源性DR6跨膜结构域。7.根据权利要求3至6中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述跨膜结构域为ROR1跨膜结构域。8.根据权利要求3至7中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述报告基因蛋白为β半乳糖苷酶。9.根据权利要求3至8中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述核酸序列可操作地连接至内源性DR6转录调控序列。10.根据权利要求1至9中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述经基因修饰的啮齿动物对于所述经修饰的内源性DR6基因座是杂合的。11.根据权利要求1至10中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物表现出运动神经元功能紊乱。12.根据权利要求11所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述运动神经元为上运动神经元或下运动神经元。13.根据权利要求12所述的经基因修饰的啮齿动物，其中在所述啮齿动物大于4周龄以前，所述运动神经元功能紊乱在盲法主观神经系统评分测定、转杆测试、猫步测试、旷场测试和体重测量中并不明显。14.根据权利要求1至13中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中与对照啮齿动物相比，所述啮齿动物表现出伤害感受减弱。15.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。16.根据权利要求15所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物为包含经修饰的内源性DR6基因座的小鼠，所述经修饰的内源性DR6基因座缺少编码整个成熟DR6蛋白的第一核苷酸序列，并且其中所述内源性小鼠DR6基因座包含可操作地连接至至少一个内源性DR6转录调控序列，即编码内源性DR6信号肽的核酸序列，所述内源性DR6信号肽可操作地融合至ROR1跨膜结构域，所述ROR1跨膜结构域可操作地融合至β-半乳糖苷酶。17.根据权利要求16所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述小鼠来自选自129品系、C57BL/6品系和混合C57BL/6×129品系的品系，并且其中在介于8周龄和20周龄之间，所述小鼠与对照野生型动物相比表现出体重增加减缓。18.一种来源于根据权利要求1至17中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物的细胞或组织。19.根据权利要求18所述的细胞或组织，其中所述细胞为运动神经元或胚胎干细胞。20.一种产生根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括从所述啮齿动物的内源性DR6基因座缺失编码整个DR6胞质结构域的第一内源性核苷酸序列的步骤。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述缺失步骤包括用编码跨膜结构域和/或报告基因的核酸序列替换编码全长和内源性成熟DR6蛋白的第二内源性核苷酸序列，其中所述核酸与内源性DR6转录调控和信号肽序列可操作地连接。22.一种产生与对照运动神经元细胞相比表现出氧化应激反应增加的运动神经元群的方法，所述方法包括由从根据权利要求1至17中任一项所述的啮齿动物分离的内细胞团胚胎干细胞形成胚体，以及将所述胚体分化成所述运动神经元群。23.一种筛选候选试剂以用于调节运动神经元功能紊乱的方法，所述方法包括：(a)向在其基因组中包含经修饰的内源性DR6基因座的啮齿动物施用候选试剂，所述经修饰的内源性DR6基因座缺少编码整个DR6胞质结构域的第一核苷酸序列，其中所述啮齿动物表达出运动神经元功能紊乱；以及(b)确定相比于测试对照啮齿动物，所述候选试剂对所述啮齿动物的所述运动神经元功能紊乱的至少一种症状的任何调节作用；其中相比于所述测试对照啮齿动物，存在对所述啮齿动物的所述运动神经元功能紊乱的所述至少一种症状的调节作用表示所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·伊基兹，M·拉克鲁瓦福拉丽什，S·D·克罗尔，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US