【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于使用在线非变性质谱来进行完全病毒衣壳、部分病毒衣壳和空病毒衣壳(例如，aav衣壳)的定量测定的方法。
技术介绍
1、腺相关病毒(aav)代表治疗性基因递送的领先平台，目前市场上有多种fda批准的基于aav的疗法，并且有超过250种正在进行临床试验的候选疗法。这类疗法的快速发展对强大的分析方法提出了很高的要求，所述强大的分析方法能够有效地监测产物质量，以确保安全性和有效性以及支持制备和过程开发。
2、分析超速离心(auc)是一种广泛用于溶液中的大分子的定量分析的方法。auc在各种溶剂和各种溶质浓度的生物大分子研究中具有广泛的应用。在沉降速度分析超速离心(sv-auc)中，溶质在高离心场中的运动可使用定义大分子的大小、形状和相互作用的流体动力学理论来解释。沉降平衡是一种热力学方法，其中通过分析较低离心场处的平衡浓度梯度来定义分子质量、组装化学计量、缔合常数和溶液非理想性。sv-auc可以用于测定样品的均匀性并且提供溶液中存在的物质的性质的详细图片(cole等人,methods cell biol.,84:143-179,2008)。
3、在aav分析的背景中，sv-auc被认为是一种最先进的方法，因为它为不同血清型的aav的分析提供高分离度和广泛适用性(khasa等人,molecular therapy:methods andclinical development,21:585-591,2021)。然而，sv-auc可能很耗时(例如，大约>5小时)，并且需要的样品量在500μl的范围
技术实现思路
1、本公开提供了在线非变性质谱(ms)方法，所述在线非变性质谱方法提供完全病毒衣壳、部分病毒衣壳和空病毒衣壳(例如，aav衣壳)的快速和定量评估。这些方法对衣壳检测具有高灵敏度(lod≈1μg/ml)，因此适用于低效价和过程中样品。
2、在一个方面，本公开提供了一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，其中所述方法包括：(a)将所述病毒颗粒样品引入在线非变性液相色谱质谱(lc-ms)系统，其中所述lc-ms系统包括与电喷雾电离发射器流体连通的液相色谱柱、质谱仪和气体入口端口；(b)通过所述液相色谱柱分离所述病毒颗粒样品中的病毒衣壳组分；(c)通过所述气体入口端口使所述病毒衣壳组分与电荷减少剂接触，然后对所述病毒衣壳组分进行质谱分析；以及(d)通过质谱分析来鉴定所述样品中的病毒衣壳组分的原始级分量，以测定所述病毒颗粒样品中的两种或更多种完整病毒衣壳组分中的每种完整病毒衣壳组分的相对丰度。
3、在一些实施方案中，病毒颗粒样品包含腺相关病毒(aav)颗粒。在一些情况下，aav颗粒具有血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav-dj、aav-dj/8、aav-rh10、aav-retro、aav-php.b、aav8-php.eb或aav-php.s。在一些情况下，aav颗粒具有血清型aav1、aav5或aav8。
4、在一些实施方案中，病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。在一些实施方案中，病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。
5、在一些实施方案中，液相色谱柱是尺寸排阻色谱(sec)柱。
6、在一些实施方案中，电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。在一些情况下，电荷减少剂包括异丙醇和三乙胺的组合。在一些情况下，使病毒衣壳组分与氮气(例如，脱溶剂气)中的电荷减少剂接触。
7、在一些实施方案中，电喷雾电离发射器包括八个喷嘴。在一些实施方案中，质谱仪是电荷检测质谱仪。
8、在一个方面，本公开提供了一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，其中所述方法包括：(a)对所述病毒颗粒样品进行在线非变性电喷雾电离质谱(esi-ms)，以鉴定病毒衣壳组分的原始级分量，其中对所述样品进行色谱分离并接受电荷减少剂，然后进行非变性esi-ms；以及(b)测定所述病毒颗粒样品中的所述完整病毒衣壳组分的相对丰度。
9、在一些实施方案中，病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。在一些实施方案中，病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。
10、在一些实施方案中，病毒颗粒样品包含腺相关病毒(aav)颗粒。在一些情况下，aav颗粒具有血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav-dj、aav-dj/8、aav-rh10、aav-retro、aav-php.b、aav8-php.eb或aav-php.s。在一些情况下，aav颗粒具有血清型aav1、aav5或aav8。
11、在一些实施方案中，使用尺寸排阻色谱(sec)柱来进行色谱分离。
12、在一些实施方案中，电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。在一些情况下，电荷减少剂是异丙醇和三乙胺的组合。
13、在上文或本文讨论的方法中的任一种中，样品样品包含≤1000ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤500ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤100ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤50ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤10ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含约5ng病毒衣壳组分。
14、在上文或本文讨论的方法中的任一种中，样品中的病毒衣壳组分的浓度可以为1μg/ml至200μg/ml。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于100μg/ml。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于50μg/ml。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于10μg/ml。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于5μg/ml。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度为约1μg/ml。
15、在一个方面，本公开提供了一种纯化病毒颗粒的组合物的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和组合物的样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定包括上文或本文讨论的方法。
16、在一个方面，本公开提供了一种监测病毒颗粒样品在一定时间段内的稳定性的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定包括上文或本文讨论的方法，并且其中完整病毒衣壳组分的相对丰度在初始时间点测定并且在初始时间点之后的一个或多个时间点再次测定。
17、在稳定性监测方法的一些实施方案中，与在初始时间点的相对丰度相比，在一个或多个时间点的完整病毒衣壳组分的相对丰度的变化指示病毒颗粒样品在所述时间段内的稳定性。在一些情况下，将病毒颗粒样品在指定条件下储存所述时间段。在一些情况下，指定条件包括湿度条件和/或温度条件。在一些情况下，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中病毒颗粒样品包含腺相关病毒(AAV)颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述液相色谱柱是尺寸排阻色谱(SEC)柱。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。
9.如权利要求
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述电喷雾电离发射器包括八个喷嘴。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述质谱仪是电荷检测质谱仪。
12.一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，所述方法包括：
13.如权利要求12所述的方法，其中所述病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。
15.如权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒样品包含腺相关病毒(AAV)颗粒。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。
18.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述色谱分离使用尺寸排阻色谱(SEC)柱来进行。
19.如权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述样品包含≤1000ng病毒衣壳组分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述样品包含≤500ng病毒衣壳组分。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述样品包含≤100ng病毒衣壳组分。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述样品包含≤50ng病毒衣壳组分。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述样品包含≤10ng病毒衣壳组分。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述样品包含约5ng病毒衣壳组分。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度为1μg/mL至200μg/mL。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于100μg/mL。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于50μg/mL。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于10μg/mL。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于5μg/mL。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度为约1μg/mL。
32.一种纯化病毒颗粒的组合物的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和所述组合物的样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的所述测定包括如权利要求1至31中任一项所述的方法。
33.一种监测病毒颗粒样品在一定时间段内的稳定性的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和所述病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的所述测定包括如权利要求1至31中任一项所述的方法，并且其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度在初始时间点测定并且...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中病毒颗粒样品包含腺相关病毒(aav)颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述aav颗粒具有血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav-dj、aav-dj/8、aav-rh10、aav-retro、aav-php.b、aav8-php.eb或aav-php.s。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述aav颗粒具有血清型aav1、aav5或aav8。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述液相色谱柱是尺寸排阻色谱(sec)柱。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述病毒衣壳组分在氮气中与所述电荷减少剂接触。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述电喷雾电离发射器包括八个喷嘴。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述质谱仪是电荷检测质谱仪。
12.一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，所述方法包括：
13.如权利要求12所述的方法，其中所述病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。
15.如权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒样品包含腺相关病毒(aav)颗粒。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述aav颗粒具有血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav-dj、aav-dj/8、aav-rh10、aav-retro、aav-php.b、aav8-php.eb或aav-php.s。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述aav颗粒具有血清型aav1、aav5或aav8。
18.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述色谱分离使用尺寸排阻色谱(sec)柱来进行。
19.如权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述样品包含≤1000ng病毒衣壳组分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述样品包含≤500ng病毒衣壳组分。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述样品包含≤100ng病...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。