一种ALS患者特异性运动神经元的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种ALS患者特异性运动神经元的制备方法。该方法包括如下步骤：(1)对离体的携带ALS相关基因突变的ALS病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到携带所述ALS相关基因突变的诱导多能干细胞(ALS‑iPSC)；(2)对ALS‑iPSC进行基因编辑，特异性消除ALS相关基因突变，得到基因矫正的诱导多能干细胞(cALS‑iPSC)；(3)对cALS‑iPSC和ALS‑iPSC分别进行定向诱导分化，即得不携带或携带所述ALS相关基因突变的ALS病人特异性运动神经元。本发明专利技术获得的携带ALS致病基因突变的运动神经元可以作为有效的平台进行高效高通量的个性化药物筛选，不携带ALS致病基因突变的运动神经元有望用于ALS的治疗与预防。本发明专利技术为ALS疾病研究、开发疾病模型、研究疾病的发病机制并进行疾病治疗奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体一种ALS患者特异性运动神经元的制备方法。
技术介绍
人肌肉萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateralsclerosis，简称ALS)是一种神经退行性疾病，主要病理特征为运动神经元退行性病变，导致病人肌肉萎缩，瘫痪，甚至会影响呼吸系统，危及病人生命。ALS发病迅速，多数病人发病3-5年后死亡。ALS分为两种类型，散发性(sporadicALS，SALS)和家族性(familialALS，FALS)。二者临床症状类似，但是致病机理都不清楚，也没有有效的药物治疗。SALS成因复杂，可能由于环境因素和遗传因素共同作用。研究发现FALS一般是由某基因杂合突变引起，如SOD1，FUS，C9ORF72，TARDBP等。SOD1基因突变是最早发现与FALS相关的致病基因，由SOD1基因突变导致的ALS病人约占FALS病人的20％。针对SOD1基因突变的致病机理研究大多集中在模式生物(如小鼠)中进行。研究发现，SOD1基因突变影响生物体的氧化还原稳态，容易形成疏水的凝聚物，干扰蛋白质降解途径，破环蛋白质稳态，影响线粒体功能，引起细胞凋亡。最近还有报道称，S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元的制备方法，为如下方法A或方法B：方法A：不携带ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元的制备方法，包括如下步骤：(1)对离体的携带ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到携带所述ALS相关基因突变的诱导多能干细胞，记为ALS‑iPSC；(2)对所述ALS‑iPSC进行基因编辑，特异性消除所述ALS相关基因突变，得到基因矫正的诱导多能干细胞，记为cALS‑iPSC；(3)对所述cALS‑iPSC进行定向诱导分化，即得不携带所述ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元；方法B：...

【技术特征摘要】
1.一种人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元的制备方法，为如下方法A或方法B：方法A：不携带ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元的制备方法，包括如下步骤：(1)对离体的携带ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到携带所述ALS相关基因突变的诱导多能干细胞，记为ALS-iPSC；(2)对所述ALS-iPSC进行基因编辑，特异性消除所述ALS相关基因突变，得到基因矫正的诱导多能干细胞，记为cALS-iPSC；(3)对所述cALS-iPSC进行定向诱导分化，即得不携带所述ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元；方法B：携带ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元的制备方法，包括如下步骤：(1)对离体的携带ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到携带所述ALS相关基因突变的诱导多能干细胞，记为ALS-iPSC；(2)对所述ALS-iPSC进行定向诱导分化，即得携带所述ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述重编程为将OCT3/4基因、SOX2基因、KLF4基因、LMyc基因和LIN28基因共同导入所述离体的携带ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人来源的成纤维细胞中，并培养至获得所述ALS相关基因突变的诱导多能干细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述ALS相关基因突变为FUSG1566A或SOD1A272C；在所述方法A的步骤(2)中，所述“特异性消除所述ALS相关基因突变”为将所述FUSG1566A矫正为FUSG1566G，或将所述SOD1A272C矫正为SOD1A272A。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述方法A中，所述步骤(2)为：将gRNA表达质粒、Cas9表达质粒和重组模板共同转入所述ALS-iPSC，并培养至获得所述cALS-iPSC；当所述ALS相关基因突变为FUSG1566A时，所述gRNA表达质粒中的gRNA的识别区域序列为序列表中序列1；所述重组模板为序列表中序列2所示的双链DNA；当所述ALS相关基因突变为SOD1A272C时，所述gRNA表达质粒中的gRNA的识别区域序列为序列表中序列3；所述重组模板为序列表中序列4所示的双链DNA。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：在所述方法A的步骤(3)或所述方法B的步骤(2)中，对所述cALS-iPSC或所述ALS-iPSC进行定向诱导分化是按照包括如下步骤的方法进行的：(3-1)将所述cALS-iPSC或所述ALS-iPSC接种到含有预先用丝裂霉素灭活处理过的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层体系中用cDF12培养基培养，得到待分化细胞；(3-2)在MN培养基1中对所述待分化细胞进行第一次分化培养，得到第一次培养后细胞；(3-3)在MN培养基2中对所述第一次培养后细胞进行第二次分化培养，得到第二次培养后细胞；(3-4)在MN培养基3中对所述第二次培养后细胞进行第三次分化培养，得到第三次培养后细胞；(3-5)在MN培养基4中对所述第三次培养后细胞进行第四次分化培养，得到第四次培养后细胞；(3-6)在MN培养基5中对所述第四次培养后细胞进行第五次分化培养，得到第五次培养后细胞，即为不携带所述ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元或者携带所述ALS相关基因突变的人肌肉萎缩侧索硬化症病人特异性运动神经元。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述cDF12培养基的组成如下：将DMEM/F12培养基和Knockout血清替代物按照8:2的体积比混合后，向混合液中加入非必需氨基酸、GlutaMAX、青霉素/链霉素、β-巯基乙醇和人FGF2，使得所述非必需氨基酸的终浓度为0.1mM，所述GlutaMAX的终浓度为1mM，所述青霉素/链霉素的终浓度为10g/L，所述β-巯基乙醇的终浓度为55μM，所述人FGF2的终浓度为10ng/ml；和/或所述MN培养基1的组成如下：将AdvancedDMEM/F12培养基和Neurobasal培养基按照1:1的体积比混合后，向混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光慧，曲静，王丽霞，任若通，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11