一种利用共表达重组菌株转化生产α‑酮戊二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用共表达重组菌株转化生产α‑酮戊二酸的方法,属于生物技术领域。本发明专利技术从链霉菌中筛选获得一种新型L‑谷氨酸氧化酶,将其在大肠杆菌中诱导表达纯化并进行酶学性质研究，发现该酶在pH 5.5~7.0时具有较高活性，最适反应温度为30~45 ℃，Vmax为100~150 U/mg，Km为8~10 mM。将L‑谷氨酸氧化酶的原始基因序列进行密码子优化，并与来源于大肠杆菌的过氧化氢酶基因进行质粒共表达，构建共表达重组菌株。以该重组菌株为全细胞催化剂转化L‑谷氨酸（盐），反应9 h后α‑酮戊二酸产量达到76.08 g/L，摩尔转化率为96.8 %。本发明专利技术解决了α‑酮戊二酸生产步骤繁琐、产率低、造成环境污染等问题，实现了α‑酮戊二酸高产率、一步法生产,具有较高的工业应用价值。

Based on a common expression method of alpha ketoglutarate production recombinant strain transformation

The invention discloses a method of using co expression recombinant strain alpha ketoglutaric acid production, which belongs to the field of biotechnology. The present invention obtained a new L glutamate oxidase from Streptomyces, its expression in Escherichia coli induced by purification and characterization, found that the enzyme has high activity in pH 5.5~7.0, the optimal reaction temperature of 30~45 C, Vmax 100~150 U/mg Km 8~10, mM. The original sequence of L gene glutamate oxidase by codon optimization and catalase gene from Escherichia coli were co expression plasmid, to construct the co expression recombinant strains. The recombinant strain for whole cell catalyst conversion L glutamic acid (salt), 9 h after the reaction alpha ketoglutarate production reached 76.08 g/L Moore, the conversion rate was 96.8%. The invention solves the alpha ketoglutarate production steps, low yield, environmental pollution and other issues, the alpha ketoglutaric acid high yield, one-step production, and has high industrial application value.

【技术实现步骤摘要】
一种利用共表达重组菌株转化生产α-酮戊二酸的方法
本专利技术涉及一种利用共表达重组菌株转化生产α-酮戊二酸的方法，属于生物

技术介绍
L-谷氨酸氧化酶(L-glutamateoxidase,LGOX)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的黄素蛋白酶类，能够在不添加外源性辅助因子的条件下专一性地氧化谷氨酸生成过氧化氢、氨和α-酮戊二酸[1]。α-酮戊二酸(α-KG)作为三羧酸循环和氨基酸代谢中重要的二元酸，在氨基酸形成和氮转运中扮演着重要角色，被广泛应用于医药、精细化工、食品和动物饲料等领域[2]。目前，α-KG的生产方法包括化学合成法、发酵法、生物催化法。传统α-KG生产采用化学合成法，但化学合成工艺中所使用的强酸强碱、氰化物等有害试剂，不仅容易引起环境污染，更限制了其在食品、化妆品和医药等行业的应用[3]。微生物发酵法α-KG产量可达186g/L，但发酵周期长达117h[4]，并且发酵产物中丙酮酸，富马酸等副产物的产生会增加后续α-KG提取的难度和费用,不适合大规模生产。酶法生产α-KG具有反应周期短、转化率高等优势，牛盼清等[5]通过诱变获得高产LGOX的链霉菌突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用共表达重组菌株转化生产α‑酮戊二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）本专利技术通过生物信息学方法，筛选获得一种新型L‑谷氨酸氧化酶基因；（2）将上述步骤中获得的L‑谷氨酸氧化酶基因在大肠杆菌中表达，并进行L‑谷氨酸氧化酶蛋白的诱导表达纯化；（3）将上述步骤中获得的纯化的L‑谷氨酸氧化酶进行酶学性质测定；（4）将上述步骤中获得的L‑谷氨酸氧化酶基因进行密码子优化，并在大肠杆菌中诱导表达；（5）将上述步骤中获得的密码子优化后的L‑谷氨酸氧化酶基因与过氧化氢酶基因KateE进行质粒共表达，并构建共表达重组菌株；（6）利用上述步骤中构建的共表达重组菌株作为全细胞催化剂转化L‑谷氨酸（盐）生...

【技术特征摘要】
1.一种利用共表达重组菌株转化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）本发明通过生物信息学方法，筛选获得一种新型L-谷氨酸氧化酶基因；（2）将上述步骤中获得的L-谷氨酸氧化酶基因在大肠杆菌中表达，并进行L-谷氨酸氧化酶蛋白的诱导表达纯化；（3）将上述步骤中获得的纯化的L-谷氨酸氧化酶进行酶学性质测定；（4）将上述步骤中获得的L-谷氨酸氧化酶基因进行密码子优化，并在大肠杆菌中诱导表达；（5）将上述步骤中获得的密码子优化后的L-谷氨酸氧化酶基因与过氧化氢酶基因KateE进行质粒共表达，并构建共表达重组菌株；（6）利用上述步骤中构建的共表达重组菌株作为全细胞催化剂转化L-谷氨酸（盐）生产α-酮戊二酸。2.根据权利要求1所述的一种利用共表达重组菌株转化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述步骤（1）中L-谷氨酸氧化酶基因来源于Streptomycesmobaraensis。3.根据权利要求1所述的一种利用共表达重组菌株转化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述步骤（2）中表达条件为：将含有L-谷氨酸氧化酶基因的重组质粒转化大肠杆菌，37℃过夜活化，2%接种量转接置LB培养基，培养OD600为0.6~0.8，加0.4mMIPTG，25~30℃诱导6~8h；收集菌体，用20mMpH8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(500mMNaCl)重悬菌体，进行超声破碎；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘君，马小倩，徐宁，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12