β-折叠的脂质小体脂肪氧化酶制造技术

本发明专利技术涉及编码一种多肽的分离的核酸序列，它是由脂肪酸或脂类代谢的生物合成核酸序列与下列核酸中的一种核酸序列联合组成：ａ）具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列的核酸序列，ｂ）从如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列中通过遗传密码子的简并衍生出的核酸序列，ｃ）如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列的衍生序列，它编码具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少６０％的同源性，ｄ）具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示序列或者具有此序列编码区的氨基末端部分的一种核酸序列。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种将有关脂类或脂肪酸生物合成的蛋白质靶向进入脂质体或脂质小体的方法。本专利技术涉及在产油植物中生产脂肪酸或脂类的方法。而且，本专利技术涉及编码一种多肽的核酸序列，它是由脂肪酸或脂类代谢的生物合成核酸序列和编码定位蛋白质的核酸序列联合组成的。而且，本专利技术涉及包含这些序列的核酸构建体，载体，和包含这些核酸、核酸构建体和/或载体的转基因生物体。油料作物在人类的营养中起着重要的作用。在萌发种子中，由于三酰基甘油酯-贮备植物中的内生贮藏量减少，即使在缺乏光照的情况下也可以重新生产新的组织。三酰基甘油酯尤其贮备在高特异性的组织中，例如，胚乳或子叶。这类细胞包含贮备脂肪的脂质小体间隔体。开始发芽时，脂质小体及其内含物降解，并且为乙醛酸循环体提供脂肪酸，乙醛酸循环体可以使脂肪酸发生β-氧化。在黄瓜的子叶中，磷脂酶A2(PLA)和脂肪氧化酶的特异性同工型体的合成是在三酰基甘油酯带动转移这一步进行，并且被运输到脂质小体中。PLA通过破坏脂质小体的磷脂单层而在引发带动转移的过程，(patatin-类蛋白))中起着决定性的作用。脂肪氧化酶随后引发三酰基甘油酯中的主要以亚油基基团形式存在的酰基修饰。经过还原和特异性的羟基十八碳二烯酰-(hydroxyoctadecadienoyl)-依赖型脂肪酶的作用，S-13-羟基十八碳二烯酸酯(hydroxyoctadecadienoate)最终从脂质小体释放到细胞质中然后被乙醛酸循环体分解。在脂类发生转移过程中，包括LBLOX和PLA在内的一组重新合成的蛋白被运输到脂质小体的表面。早期的研究工作表明LBLOX和PLA的合成是瞬时的，也就是仅在脂类转移开始的一段很短的时期内被合成。对于植物细胞内部的这些蛋白的运输过程仍完全不清楚。本专利技术的目的是了解细胞内运输的信号和利用这些信号定位蛋白质。我们已经发现可以通过将有关脂类和脂肪酸生物合成的蛋白靶向进入脂质体或脂质小体的方法来实现本专利技术的目的，方法包括将蛋白质-编码核酸与如下序列的其中一个序列组合得到联合蛋白-编码序列a)具有如SEQ ID NO1所示序列的核酸序列，b)从如SEQ ID NO1所示序列中通过遗传密码子的简并衍生出的核酸序列，c)如SEQ ID NO1所示序列的衍生序列，它编码具有如SEQ ID N02所示的氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少60％的同源性，d)具有如SEQ ID NO3所示序列或者具有此序列编码区的氨基末端部分的核酸序列，并且将获得的序列引入真核生物体。本研究工作已经提供了LBLOX和PLA在翻译后转移到脂质小体的证据。研究表明折叠成β-折叠结构的脂质小体LOX的N末端结构域，负责形成酶的膜结合特性。由本专利技术核酸序列编码的蛋白质的这个结构域，具有膜靶定位的结构，可以将它用于本专利技术的蛋白质靶向方法，使外来蛋白进入如油料种子的脂质小体中。本专利技术的方法可以指导优选有关于脂肪酸和/或脂类代谢的蛋白质特异性地到达需要合成的位点。通过将核酸序列引入真核生物体，可以以本专利技术方法对蛋白质进行引导。为此，在适当的培养基中对生物体进行培养。本专利技术还涉及将有关脂类和脂肪酸合成脂质体和脂质小体蛋白质靶向进入的一种方法，包括按照下文描述的方法将至少本专利技术的一个核酸序列，或将至少一个核酸构建体引入产油生物体。生产脂肪酸的方法，包括将至少本专利技术的一个核酸序列，或将至少一个核酸构建体引入产油生物体，培养该生物体，并从生物体中分离出油。生产脂肪酸的方法，包括将至少本专利技术的一个核酸序列，或将至少一个核酸构建体引入产油生物体，培养该生物体，从生物体中分离出油并且释放出脂肪酸。在如上所述方法中，生物体包括植物或真核微生物。如上文描述的“培养该生物体”可以理解为既指植物的培植也指真核微生物例如酵母，真菌，纤毛虫，藻类的培养，或者动物或植物细胞或细胞联合体的培养。所述方法中可能提及的生物体有，例如，植物如拟南芥属，大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米，大豆，水稻，棉花，甜菜，茶，胡萝卜，辣椒，canola，向日葵，亚麻，大麻，马铃薯，黑小麦，烟草，西红柿，油菜，咖啡，木薯粉，木薯，竹芋，万寿菊，紫花苜蓿，花生，蓖麻，椰子，油棕榈，红花(Carthamus species)，莴苣和各种树木，坚果和葡萄，或可可豆，微生物如Yarrowia或酿酒属酵母；如被孢霉属，水霉属，破囊壶菌属或腐霉属真菌；藻类和原生动物如腰鞭目，如Crypthecodinium。优选的生物为那些能天然合成大量油类的种类，例如微生物如酵母有Yarrowialypolytica或酿酒酵母；真菌有高山被孢霉，坐生腐霉；植物有鼠耳芥，大豆，油菜(Braccica napus)，椰子，油棕榈，canola，红花(Carthamusspecies)，蓖麻，金盏花，亚麻子(Linium usitatissimum)，琉璃苣，花生，可可豆或向日葵，其中大豆，油菜，或向日葵为最优选。利用本专利技术的方法获得的生物体中，优选含有以结合脂肪酸形式存在的饱和或不饱和脂肪酸，即不饱和脂肪酸主要采取单-，双-，或三酰甘油酯，糖酯，脂蛋白或磷酸酯如油类或脂类的形式，或者作为酯或酰胺结合的脂肪酸的形式。游离脂肪酸也以游离或它的盐的形式存在于生物体中。在本专利技术方法中，通过培养获得的生物体，以及所包含的饱和或不饱和脂肪酸，都可以被直接利用，例如生产药品制剂，农用化学品，饲料或食品，或者首先从生物体中分离出脂肪酸。可以使用所有分离过程中的饱和或不饱和脂肪酸，即从脂肪酸的粗提取物到完全纯化的脂肪酸都适用于制备上述产品。在优选的具体实施案例中，通过，例如碱(如NaOH或KOH)水解，可以将结合脂肪酸从例如油或脂类中释放出来。对于这些游离脂肪酸，既可以直接利用所获得的混合物也可以利用经过进一步的纯化之后的产物，来生产药品制剂，农用化学品，饲料或食品。也可以利用结合或游离的脂肪酸与其它例如单-，双-或三甘油酯或甘油进行转酯或酯化反应，以提高这些化合物，如三酰基甘油酯中不饱和脂肪酸的比例。在上述的制备方法中根据不同宿主生物，采用技术人员所熟知的不同生长和培养方法。微生物如细菌，真菌，纤毛虫，或者植物或动物细胞通常是在液体培养基中进行培养，液体培养基含有碳源，常用的是糖；氮源常用的是有机氮源如酵母膏，或盐，如硫酸铵；微量元素，如铁盐，锰盐，镁盐；如果需要还加入维生素；培养温度在0℃到100℃之间，优选温度在10℃到60℃之间，根据生物体的不同，在通氧或无氧的条件下进行培养。液体培养基的pH可以保持在一个恒定值，即在培养过程中控制pH，或者在培养过程中不控制pH而使其发生变化。培养可按分批培养、半分批培养和连续培养的方式进行。营养的供给可以在发酵开始时投入，也可以在半分批和连续培养的过程中补加。培养也可以在固体培养基上进行。经过转化之后，植物通常是首先被再生出来，然后像通常一样进行生长或栽培。这一步可以在温室或户外进行。生物体长成以后，就可以以常规方式获得脂类。为此，首先可以将生物体收集并破碎，或者可以直接利用。最好是利用适当的溶剂抽提脂，用于抽提的溶剂例如非极性溶剂(如己烷)，或乙醇，异丙醇，或者是混合溶剂如己烷/异丙醇，苯酚/氯仿/异戊醇，温度在0℃-80℃之间，优选温度在20℃-50℃之间。通常，以过量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一段分离的核酸序列，它编码一条多肽并且由脂肪酸或脂类代谢的生物合成核酸序列的核酸序列与选自下列的一种核酸联合组成：ａ）具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列的一段核酸序列，ｂ）从如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列经过遗传密码的简并衍生得 到的核酸序列，ｃ）如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示核酸序列的衍生序列，它编码具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示氨基酸序列的多肽并且在氨基酸水平上具有至少６０％的同源性，ｄ）具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示序列或者具有此序列编码区的氨基－末 端部分的核酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H金德勒，C迈，I福斯纳，
申请(专利权)人：巴斯福股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]