重组昆虫杆状病毒和制备方法及其作为杀虫剂的应用技术

本发明专利技术公开了一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，制备该重组多角体病毒的方法及重组多角体病毒单独或以组合物方式作杀虫剂的应用。本发明专利技术提供的重组多角体病毒，由于含有截短的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙｌＡ（ｃ）基因序列以及多角体外膜基因ｐｅ↑［－］缺失，杀虫谱扩大，而且病毒能迅速地在昆虫的中肠里碱解，产生快速的杀死昆虫的作用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，本专利技术涉及一种重组的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、制备方法及作为杀虫剂的应用。
技术介绍
从1975年第一个野生型杆状病毒杀虫剂(HzNPV-棉铃虫核型多角体病毒)在美国批准注册以来，先后有30多种商品化或实验性质的野生型杆状病毒杀虫剂被开发出来。其中以苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)杀虫剂应用最广。但野生型杆状病毒的缺点是杀虫谱单一，杀虫速度慢，施用后7～14天才表现出杀虫活性。因此，近年来应用基因工程手段改造野生型杆状病毒成为克服其上述缺点的重要途径，目前大多数都是改造AcNPV，如O’Reilly和Miller认为，通过鉴定并修饰或者缺失AcNPV基因组中某种非必需基因有可能提高杆状病毒的杀虫效果，在1991年他们首先构建出缺失的最早发现于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)中的蜕皮激素UDP葡萄糖基转移酶基因(ecdysterioid UDPglucosferase gene，egt)AcNPV病毒，发现这种重组病毒感染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)幼虫地死亡速度比野生型快30％，但速度仍较慢，且杀虫谱没有扩大。在1989年Maeda将烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)的利尿素基因插入到家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV，BmNPV)中并在多角体启动子的控制之下。注射感染家蚕，杀虫速度有所改善。此后陆续有在AcNPV病毒中插入昆虫基因促前胸腺激素(PTTH)、保幼激素脂酶(JHE)、几丁质酶等昆虫基因，插入北非蝎AalT、Bt内毒素等昆虫特异性毒素基因和在AcNPV病毒中表达反义RNA等方面的报道。这些方法产生的重组病毒的杀虫速度与野生型杆状病毒相比最高提高了28％，并有效地减少了宿主的进食损失。但还是存在着杀虫速度不能适应农业生产的快速致害虫死亡的要求，而且杀虫谱单一的问题也没有解决。苏云金杆菌(BT)作为杀虫剂在国内外农业生产中得到了很好的应用(喻子牛，1993，苏云金芽孢杆菌制剂的生产和应用，p1-11)，杆状病毒作为昆虫致病因子在害虫生物防治上也显示出良好的前景，因此，人们一直希望能将苏云金杆菌中某些在杀虫中起主导作用的基因克隆到昆虫杆状病毒基因组中，并使其得到表达，从而将苏云金芽孢杆菌和昆虫杆状病毒的各自优势整合到一起。众多学者对此进行了研究，但由于外源效应基因的选择、启动子的强弱、基因的插入位点、选择性标记及重组病毒能否口服感染等在分子水平上的差异和操作的困难，研究结果与农业生产要求的杀虫速度快、杀虫谱广，还存在着较大差距。如国外Mcrrycoeather等(1990)曾将全长的Bt kurstaki亚种的cry1A(c)基因插入到AcNPV的p10启动子下游、Martens等(1990)将全长的cry1A(b)基因插入到AcNPV的多角体蛋白基因编码区构建重组病毒，但杀虫效果均未明显增强；国内庞义等(1992)将全长和截短的cryIVD插入到AcNPV的多角体蛋白基因启动子下游构建重组病毒，杀虫效果有所改善，黄永秀等(1992)构建了含全长cry1A(c)基因、多角体缺失的重组AcNPV病毒，以注射方式对粉纹夜蛾的杀虫效果比野生型病毒有较大提高。杨远征等(1995)构建了携带全长和截短cry1A(c)基因、多角体缺失的两种重组病毒，王福山等(科学通报，1995，40(20)1896-1900)构建了多角体完整、表达截短cry1A(b)基因的重组病毒，以上重组病毒在实验室测定中，通过注射或口服，杀虫毒力都有不同程度的改进。中国专利CN95117749通过一系列基因工程操作手段，在含有AcNPV的多角体基因ph的5’端插入P10启动子和3’端部份截短的苏云金杆菌σ-内毒素cry1A(b)构建成多角体完整、多角体外膜缺失的重组病毒，得到的重组病毒虽然杀虫谱扩大了一些，但由于cry1A(b)基因的毒力较弱、杀虫速度较慢，仍不能很好地满足农业生产要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，该病毒杀虫谱大，可在昆虫中肠中迅速释放，快速致有害昆虫死亡。本专利技术的另一个目的是提供一种制备重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的方法。本专利技术的再一个目的是提供一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒作为杀虫剂防治甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、小菜蛾和菜青虫的应用。本专利技术的再一个目的是提供重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂，悬浮性能好，稳定性强，提高了杀虫效果。一种重组的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV，含有野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体基因ph，其多角体外膜基因被“苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒极早期反式调控基因启动子/新霉素抗性基因”表达盒插入失活，其特征是该重组多角体病毒还含有截短的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(BTK)HD-73菌株杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列，在苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列的上游是多角体基因启动子Pph序列，该重组杆状病毒是携带有苏云金芽孢杆菌(Bt)截短杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)、多角体蛋白基因完整(ph+)、多角体外膜基因缺失(pe-)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒vAcPhBcPE-。在本专利技术的一个优选方案中，该重组多角体病毒还含有庆大霉素(Gm)和卡那霉素(Kan)抗性标记基因序列，该重组病毒在苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列上游的多角体基因启动子序列前含有庆大霉素抗性标记基因序列；在庆大霉素抗性标记基因序列前是卡那霉素抗性基因序列。在本专利技术的一个更优选方案中，截短的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列是SEQ ID NO1所示序列aggtacctga tagtgtgacg taattttctt taaatacgtc atcccctcct tggatggtaatccctgtact tccgccccac ccacgttctg gttgcctatt aatgtctttc aaatttgaatcttggagtaa attgcgttca tcactgagtc gcttcgcatg tttgactttc tcggacaattctcgcttttc atccagacaa aattcatccg ataaatacgt aactaaattg gacacttgatcaatatgata atccgttaca tttgttttta gccctagttg gtttgtagac gtaaacagcgcattcaccgc cttctgcgct ctttccagat tatattcagc ctcgagtgtt gcagtaactggaataaattc aaatctgtct attatcactc ctgcagtccc actaaaattt ctaacacctactatattacc taatgaagat gtaaaagcat tggcactttc aaaataacca aaatcacttgattgtagatt atctaatgac gtagctgtag ctggtactgt attggaaaaa atggatgaattaccccaatt aacgttgagg tgaatcgggg ttacagaa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，含有野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体基因，其多角体外膜基因被苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒极早期反式调控基因启动子／新霉素抗性基因表达盒插入失活，其特征是该重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒还含有截短的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种ＨＤ－７３菌株杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙｌＡ（ｃ）基因序列，在苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种ＨＤ－７３菌株杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙｌＡ（ｃ）基因序列的上游是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体基因启动子序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：齐义鹏，杨复华，周文科，姚伦广，李凌云，肖化忠，吕颂雅，刘青珍，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]