佐剂病毒颗粒制造技术

本发明专利技术涉及具有免疫增强或佐剂性能的免疫原载体。更具体地，免疫原载体是来自马铃薯Ｘ病毒组家族、最具体地番木瓜花叶病毒的病毒样颗粒（ＶＬＰ）。重组技术生产的ＶＬＰ与其自身蛋白质之一：蛋白质免疫原融合。上述ＶＬＰ和来自病毒、细菌或寄生病原体的蛋白质或蛋白质提取物可以用作疫苗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及携带免疫原和具有免疫增强或佐剂活性的病毒颗粒。本专利技术具体涉及重组病毒颗粒和在人或动物中借助这些颗粒增强免疫应答的方法。
技术介绍
接种是最有效的抗击传染病的方法。新病毒病的出现(例如丙型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒)，和病原菌(伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhii))对抗生素的抗性是令人担忧的。接种因此成为帮助控制这些疾病的有效备选方案。在过去15年中，遗传工程允许精确鉴定负责保护性免疫应答的蛋白质片段。因此，出现新的接种策略。用适当免疫原性肽免疫动物允许生产可以控制疾病的中和抗体。那些免疫原性肽在异种系统中的表达提供亚单位疫苗的基础。尽管已经证实化学合成的寡肽能够刺激针对衍生它们的蛋白质的抗体生产，通常已发现肽本身免疫原性不足以用作疫苗。这是已经有相当大兴趣开发表位呈递系统的原因，在该系统中肽序列与能够组装成大分子结构的载体分子融合。当向宿主施用抗原时，通过使用免疫增强剂如佐剂，可以增强特异性免疫。免疫应答由免疫系统中的各种细胞介导。存在两种类型的免疫应答由抗体介导的体液免疫，和主要由细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞免疫。抗原呈递细胞(“APC”)加工和呈递抗原至B和T细胞。作为激活结果B细胞分泌特异性抗体，T细胞变成体液应答的辅助细胞或细胞毒性细胞并直接攻击抗原。佐剂已经显示增加这些免疫应答。抗原的初始呈递诱导IgM和IgG抗体，形成初次应答。然而该抗体的生产可能随时间下降。再次应答主要涉及IgG抗体的生产，可以通过第二次或时间较晚的抗原呈递引发。然而仅通过用抗原起动宿主不能保证再次应答乃至初次应答。抗原施用中经常遇到的一个困难是免疫系统响应的程度。某些抗原免疫原性不高，因为在施用后它们激发弱的初次应答或根本无应答。在这些情形中，免疫系统可能不对二次攻击响应，例如，宿主可能遭受计划防止抗原免疫的疾病或病症。在这些情形中，通常提供生理应答调节剂(“PRM”)。PRM通常定义为免疫增强化合物。它可以来源于细菌，如百日咳博德特氏菌(Bordellapertussis)或小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。PRM还可以包括化学物质，如多核苷酸，生理活性分子，如胸腺激素，和佐剂。佐剂是当与抗原施用时增强免疫系统应答的化合物，产生更高的抗体滴度和延长的宿主应答。通常使用的佐剂包括由油包水型乳状液组成的不完全弗氏佐剂，包含以上及加入的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的弗氏完全佐剂和明矾。然而在人中使用这些材料的困难例如在于它们有毒或者可导致宿主在注射位点发展损伤。Kawamura和Berzofsky在J.Immunol.，13658(1986)中描述另一种方法。在该方法中，将与某些B细胞上存在的免疫球蛋白反应的抗-Ig抗体与铁蛋白和肌红蛋白偶联，并与不完全弗氏佐剂施用于小鼠。混合物的免疫原性改善了，但没有表明未加入佐剂的混合物的免疫原性。此外，尽管佐剂如弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂和Montanide可以极大地增强对抗原的免疫应答，它们具有一些缺点。当与注射形式的抗原使用时，在注射位点经常形成大的损伤，该情形使得它们不能令人满意地用于人，宠物或肉用家畜。此外，当口服或肠内施用时，这些佐剂不能用作免疫增强剂。本领域已知不同性质的免疫原或抗原载体可以相对容易地遗传改造。植物病毒是可以在植物中生产的那些系统和容易适合于本申请。豇豆花叶病毒(CPMV)，烟草花叶病毒X(TMVX)，和苜蓿花叶病毒(AIMV)已知已经被修饰来呈递目标表位。另一种植物病毒载体，马铃薯病毒X(PVX)，马铃薯X病毒组成员，已知容忍携带完整的蛋白质外壳。此外，美国专利6,232,099和6,042,832，国际专利申请公开号WO97/39134，WO02/04007，WO01/66778，WO02/00169，和欧洲专利申请1167530，全部描述携带与内源蛋白质融合的外源蛋白质的病毒样颗粒的不同变体。然而，在这些参考文献中没有任何地方提及该颗粒具有任何免疫增强或佐剂性能。鉴于本文所述现有技术，仍有对允许强烈免疫人和动物而同时避免实际实行的佐剂和二次免疫的使用的化合物和载体颗粒的巨大需要。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供具有免疫增强性能的免疫原-载体复合体，其由携带至少一种与所述VLP的蛋白质或其片段融合的免疫原的病毒样颗粒(VLP)组成，可以用于制备诱导针对蛋白质或其片段的免疫应答的组合物。本专利技术另一目的是提供包含病毒样颗粒(VLP)和来源于病毒、细菌或寄生虫的蛋白质或提取物的组合物，其可以用作疫苗。按照本专利技术还提供在人或动物中免疫增强免疫应答的方法，其包含向所述人或动物施用免疫原-载体，其由携带至少一种与所述VLP的蛋白质或其片段融合的免疫原的病毒样颗粒(VLP)组成，或者与不与所述VLP直接连接的抗原共同施用VLP或其片段。本专利技术还涉及编码由携带至少一种与蛋白质融合的免疫原的病毒样颗粒(VLP)组成的免疫原-载体复合体的多核苷酸，或编码由所述VLP其片段、或单独VLP组成的免疫原-载体复合体的多核苷酸，当在植物细胞、动物细胞或微生物中表达时，所述免疫原-载体复合体具有组装的能力。本专利技术还提供番木瓜花叶病毒(papaya mosaic virus)作为佐剂的应用。为了本专利技术的目的以下定义下列术语。当两个或多个通常编码两个单独蛋白质的基因天然或作为人工干预的结果重组而编码那两个蛋白质各自全部或部分的组合的蛋白质时，产生表述“嵌合蛋白质”。表述“融合衣壳蛋白”是指其中融合基因之一编码植物病毒的衣壳蛋白的融合蛋白。本文所用表述“保护性免疫”意欲是指动物如哺乳动物、鸟类、或鱼抵抗(延缓症状发作或减轻症状严重程度)作为其暴露于病原体抗原的结果或在与病原体接触之后的疾病或死亡的能力。通过一种或多种下列机制实现保护性免疫粘膜，体液或细胞免疫。粘膜免疫主要是呼吸道、肠胃道和泌尿生殖道的粘膜表面上分泌的IgA(sIGA)抗体的结果。在一系列由抗原加工细胞(B和T淋巴细胞)介导的导致B淋巴细胞在身体粘膜系组织上sIGA生产的事件之后产生sIGA抗体。通过口服疫苗可以刺激粘膜免疫。保护性免疫的主要结果是破坏病原体或抑制其复制自身的能力。本文所用表述“体液免疫”是指血清中IgG抗体和IgM抗体的结果。通过细胞毒性T淋巴细胞或通过涉及巨噬细胞和T淋巴细胞的迟发型超敏反应以及不需要抗体的涉及T细胞的其它机制可以实现本文所用表述“细胞免疫”。“重组病毒”是其中病毒的遗传物质已经与其它遗传材料组合的病毒。本文所用术语“多肽”或“肽”意欲是指其中存在至少四个肽键连接的氨基酸的分子。本文所用表述“病毒核酸”可以是病毒的基因组(或其大部分)，或与该基因组碱基序列互补的核酸分子。与病毒RNA互补的DNA分子也认为是病毒核酸。与病毒DNA碱基序列互补的RNA分子也被认为是病毒核酸。本文所用术语“病毒样颗粒”(VLP)是指与病毒颗粒具有类似物理外观的自组装颗粒并且包括假病毒。病毒样颗粒可以缺少或具有功能异常的某些野生型病毒基因的拷贝，这可导致病毒样颗粒不具有野生型病毒特征的一些功能，如复制和/或细胞-细胞移动。本文所用术语“疫苗”意欲是指融合蛋白，该蛋白作为一部分的任何颗粒，或该蛋白作为一部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有免疫增强性能的免疫原－载体复合体，其由携带至少一种免疫原的病毒样颗粒（ＶＬＰ）组成，所示免疫原与所述ＶＬＰ的蛋白质或其片段融合。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：德尼勒克莱尔，纳塔莉马杰奥，菲利普泰西耶，康斯坦丁诺三氏罗伯托洛佩斯马西亚，
申请(专利权)人：德尼勒克莱尔，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]