本公开内容提供了hNGAL突变蛋白，其结合绿脓菌荧光素家族成员或绿脓菌螯铁蛋白，并且可以用于各种应用，包括药物应用，例如以抑制或降低铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的生长。本公开内容还关注生成本文中描述的一种或多种结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白的突变蛋白的方法及包含一种或多种此类突变蛋白的组合物。本公开内容进一步涉及编码此类突变蛋白的核酸分子和用于生成此类突变蛋白和核酸分子的方法。另外，本申请公开了这些突变蛋白及包含一种或多种此类突变蛋白的组合物的治疗和/或诊断用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的对绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白特异性的蛋白质I.专利技术背景铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)一种引起主要与组织损伤相关的急性感染的机会病原体。铜绿假单胞菌在留置装置上以及在具有遗传病症囊性纤维化的患者的肺组织上形成生物膜。生物膜感染难以用常规的抗生素疗法治疗。然而，研究已经证明了铁是铜绿假单胞菌的正确生物膜形成必需的，因此铁摄取系统是抗假单胞菌疗法的潜在标靶。铜绿假单胞菌能够通过使用分泌性铁结合铁载体(siderophore)绿脓菌螯铁蛋白(pyochelin)和绿脓菌荧光素(pyoverdine)从宿主环境中清除铁。绿脓菌荧光素(Pvd)是一种肽连接的氧肟酸盐-和儿茶酚盐-型(catecholate-type)配体，而绿脓菌螯铁蛋白(Pch)是水杨酸盐和两个半胱氨酸分子的且具有酚、羧酸盐和胺配体官能度的衍生化缀合物。Pvd和Pch两者都已经证明了以协同作用的某种指示在铜绿假单胞菌毒力中的作用。不能生成任一种铁载体的双重缺陷突变体比仅不能生成两种铁载体之一的单一缺陷突变体在毒力上减弱得多(Takase等,Infectionandimmunity,Apr.2000,p.1834-1839)。此外，绿脓菌荧光素作用为信号传导分子以控制几种毒力因子及绿脓菌荧光素自身的生成；同时已经提出了除三价铁外，绿脓菌螯铁蛋白可为用于获得二价金属，如二价铁和锌以实现铜绿假单胞菌的致病性的系统的一部分(Visca等,1992)。已经从几种铜绿假单胞菌菌株中鉴定出三种结构上不同的绿脓菌荧光素类型或组：从铜绿假单胞菌ATCC15692(Briskot等,1989,LiebigsAnnChem,p.375-384)，从铜绿假单胞菌ATCC27853(Tappe等,1993,J.Prakt-Chem.,335,p.83-87)以及从天然隔离群(naturalisolate)铜绿假单胞菌R(Gipp等,1991,Z.Naturforsch,46c,p.534-541)。此外，对88株临床隔离群和上文提及的两种保藏中心菌株的比较生物学调查根据下述参照菌株揭示了三种不同的菌株特异性绿脓菌荧光素介导的铁摄取系统(Cornells等,1989,InfectImmun.,57,p.3491-3497；Meyer等,1997,Microbiology,143,p.35-43)：铜绿假单胞菌ATCC15692(I型Pvd或PvdI)、铜绿假单胞菌ATCC27853(II型Pvd或PvdII)和临床隔离群铜绿假单胞菌R和pa6(III型Pvd或PvdIII)。每种绿脓菌荧光素类型具有作为琥珀酰基、琥珀酸酰胺基(succinamid)或a-酮戊二酰基的侧链上有所不同的三种成员(亚型)，即PvdI型琥珀酰基、PvdI型琥珀酸酰胺基、PvdI型α-酮戊二酰基、PvdII型琥珀酰基、PvdII型琥珀酸酰胺基、PvdII型α-酮戊二酰基、PvdIII型琥珀酰基、PvdIII型琥珀酸酰胺基和PvdIII型α-酮戊二酰基。每种铜绿假单胞菌菌株表达一种Pvd类型，即铜绿假单胞菌ATCC15692表达I型Pvd，铜绿假单胞菌ATCC27853表达II型Pvd，而铜绿假单胞菌R和pa6表达III型Pvd，从而每种Pvd类型包括相应类型的所有三种成员，并且每种所述菌株还表达绿脓菌螯铁蛋白。在这方面，我们将绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白鉴定为对于铜绿假单胞菌的致病性至关重要的靶物，并且在不产生由常规抗生素造成的强选择压力的情况下开发出针对如本文中公开的此类靶物，即针对每种Pvd类型，包括对于每种类型而言在侧链上不同的三种成员(亚型)(PvdIs，PvdIsa，PvdIαKG，PvdIIs，PvdIIsa，PvdIIαKG，PvdIIIs，PvdIIIsa，PvdIIIαKG)以及针对Pch，并且在每种情况下针对游离的铁载体及针对具有结合铁的铁载体的特异性抑制剂。此外，我们选择区别游离的和加载有铁的绿脓菌螯铁蛋白的抑制剂。作为代表PierisAG，Sanofi-Aventis和Sanofi-PasteurInc.(它们是现有联合研究协议的各方)承担的活动的结果做出本专利技术，并且在联合研究协议的范围内做出。II.定义以下列表定义了贯穿本说明书使用的术语、短语和缩写。本文中列出并定义的所有术语意图涵盖所有语法形式。如本文中使用的，“绿脓菌荧光素(pyoverdine)”意指在铁缺乏性生长条件下由革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌生成并且对铁具有高亲和力的荧光铁载体。绿脓菌荧光素由三个结构部分构成：二羟基喹啉生色团、侧链和可变肽链。肽链模块参与受体识别和结合。已经鉴定出三种不同Pvd(在它们的肽链上不同)(I-III型)。绿脓菌荧光素类型的大小和氨基酸组成及绿脓菌荧光素识别特异性对于每种物种是独特的。可以区别三种铜绿假单胞菌菌株，每种生成不同绿脓菌荧光素类型(I-III型，图1)和相关的(cognate)FpvA受体。如本文中使用的，“绿脓菌螯铁蛋白(pyochelin)”意指由铜绿假单胞菌生成并且溶解三价铁的水杨酸盐和两个半胱氨酸分子的且具有酚、羧酸盐和胺配体官能度的噻唑啉衍生化缀合物。绿脓菌螯铁蛋白是一种拥有酚盐，而既无氧肟酸盐也无儿茶酚盐模块的结构上独特的铁载体(参见图1)。如本文中使用的，“可检出的亲和力”意指以一般至少约10-5M以下的亲和常数结合选择的靶物的能力。更低的亲和力一般用常见的方法，如ELISA不再能测量到，因此是次等重要的。如本文中使用的，可通过本领域技术人员已知的多种方法测量公开内容的蛋白质(例如人脂笼蛋白(lipocalin)2的突变蛋白)或其融合多肽对选择的靶物(在本案的情况中为绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白)的“结合亲和力”(从而确定突变蛋白-配体复合物的KD值)。此类方法包括但不限于荧光滴定、直接ELISA、竞争ELISA、量热方法，如等温滴定量热学(ITC)和表面等离振子共振(surfacePlasmonresonance)(BIAcore)。此类方法是本领域中完善建立的，并且其例子也在下文详述。还注意到相应的结合剂和其配体之间的复合物形成受到许多不同因素影响，如相应结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、使用的缓冲液系统的pH和离子强度、和用于测定解离常数KD的实验方法(例如荧光滴定、直接ELISA、竞争ELISA或表面等离振子共振，仅举几例)或者甚至用于评估实验数据的数学算法。因此，技术人员还清楚的是，KD值(相应结合剂和其靶物/配体之间形成的复合物的解离常数)可以在某个实验范围内变化，这取决于用于测定特定突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着可以有测量的KD值的略微偏差或公差范围，这取决于例如通过表面等离振子共振(Biacore)，通过竞争ELISA，还是通过“直接ELISA”测定KD值。如本文中使用的，“突变蛋白”、“突变的”实体(不管是蛋白质还是核酸)或“突变体”指与天然存在(野生型)核酸或蛋白质“参照”支架相比一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。所述术语还包括如本文中描述的突变蛋白和变体的片段。优选地，本公开内容的突变蛋白、其片段或变体保留结合如本文中描述的绿脓菌荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性的多肽，其中所述多肽包含以可检出的亲和力结合绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.18 EP 15305242.81.一种对绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性的多肽，其中所述多肽包含以可检出的亲和力结合绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白。2.权利要求1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白包含在对应于下述位置的一个或多个位置处的突变氨基酸残基：成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQIDNO:1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145。3.一种核酸分子，其包含编码权利要求1或29中任一项的多肽的核苷酸序列。4.一种宿主细胞，其含有权利要求3的核酸分子。5.一种生成根据权利要求1或2中任一项的多肽的方法，其中通过遗传工程方法从编码所述多肽的核酸开始生成所述多肽。6.一种组合物，其包含一种或多种选自下组的多肽：(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的多肽和(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的多肽。7.一种结合受试者中的绿脓菌荧光素I、II、III型和/或绿脓菌螯铁蛋白的方法，其包括对所述受试者施用有效量的权...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·科维，H·斯达姆普，J·克吕普，B·卡兰德拉，A·雷伊，N·卡斯特，M·莫拉斯，L·弗雷斯，C·罗思，A·艾乐斯多尔夫，A·维德曼，M·欣纳，B·伦德，K·延森，M·许尔斯迈尔，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国,FR
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