本发明专利技术涉及一种以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，以及利用所述筛选模型筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法。本发明专利技术还涉及一种用于上述筛选模型和筛选方法的过量表达ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ蛋白之重组绿脓杆菌。本发明专利技术还涉及利用上述筛选模型和方法获得的抗绿脓杆菌药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，以及利用所述筛选模型筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法。本专利技术还涉及一种用于上述筛选模型和筛选方法的过量表达MexAB-OprM蛋白之重组绿脓杆菌。本专利技术还涉及利用上述筛选模型和方法获得的抗绿脓杆菌药物。
技术介绍
绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)，又名铜绿假单胞茵，是一种重要的院内感染条件致病菌，在机会性感染的病源菌中位于前三甲之列，经常感染癌症病人、烧伤患者等免疫力低下的病人，引起茵血症，肺炎，泌尿系统感染和囊性纤维化等疾病。由于绿脓杆菌具有先天的和后天获得的耐药性，对多种在结构和作用机制上都大相径庭的抗生素产生多重高度耐药，使临床治疗十分困难，一旦感染，死亡率很高，为临床医生面临的治疗难题之一。绿脓杆菌的耐药机理十分复杂，但其对多种抗茵药物产生多重高度耐药主要得益于如下两种机制一种是绿脓杆菌外膜通透性很低，其非特异性通透性仅为大肠杆菌的0.2％-1％；另一种是绿脓杆菌中存在着可以外排多种药物的主动外排系统。有关绿脓杆菌外排泵的作用机制、耐药机制、毒性机理的基础研究已成为全球的研究热点。目前在绿脓杆菌中已经发现了7种跨膜质子梯度能驱动(Transmembrane protongradient energy driven)的外排泵，分别命名为MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和最近发现的MexVW-OprM。对绿脓杆菌基因组数据的分析表明，可能还存在着8种潜在的外排系统。随着对外排泵研究的不断深入，人们逐渐认识到药物的外排作用不仅可以直接降低细胞内的药物浓度，提高菌体对药物的MIC值，还可以间接地通过在细胞内较低药物浓度下，对抗性突变体进行快速选择，从而进一步提高细菌的耐药水平；筛选外排泵抑制剂(efflux pumpinhibitor，EPI)，不仅可以抑制绿脓杆菌的外排作用，大大降低绿脓杆菌对药物的先天抗性，而且还可以逆转后天获得的抗性，降低临床治疗中高水平耐药菌株出现的频率，克服耐药绿脓杆菌带来的威胁。在已经发现的外排系统中，MexAB-OprM是绿脓杆菌中底物谱最广，外排作用最强的外排泵，可以外排四环素、氯霉素、喹诺酮类抗生素、新生霉素、大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂等多种广泛使用的抗生素，在绿脓杆菌的多重耐药性中起着极其重要的作用。其他几种外排泵，如MexCD-OprJ，MexEF-OprN和MexXY-OprM只在一些突变体中或是经过特殊诱导才会表达，在通常的实验室条件中，并不表达或表达量很低。对临床分离的高度耐药绿脓杆菌进行分析的结果表明绝大多数的耐药绿脓杆菌都有MexAB-OprM高表达，进一步证明了MexAB-0prM外排系统，是绿脓杆菌产生多重高度耐药性的主要原因。因此，有效抑制高度耐药的绿脓杆菌之MexAB-OprM外排系统，将有助于改善绿脓杆菌的耐药现状。国外一些著名的药物研发机构对于外排泵抑制剂的研究正如火如荼地进行。1999年的ICAAC(The Interscience Conference onAntimicrobial Agents and Chemotherapy)会议上MicrocidePharmaceutical Co.和日本第一制药株式会社共同报道了三种抗外排泵药物的成功化学合成；2001年，日本的研究人员报道了在其化合物库中筛选得到了一种外排抑制剂MC-207，110，可以使绿脓杆菌对左旋氧氟沙星的MIC值降低32到64倍，其结构也被认为是一种很有前景的先导化合物。对先导化合物MC-207110的最优化处理得到的一些广谱外排泵抑制剂，对绿脓杆菌体内有效；2002年，发现的新的外排抑制剂(MC-02,595)，可以将左旋氧氟沙星的MI C值降低8倍，一系列以此化合物为基础的研究正在展开；2003年，筛选得到了作用于MexAB-OprM外排泵的抑制剂MC-510,050，正在对该化合物的结构优化，以期获得活性更强的外排抑制剂。但是，到目前为止，还没有专门作用于外排系统的抗绿脓杆菌药物应用于临床。因此，始终需要不断筛选以早日获得能够真正用于临床的抗绿脓杆菌药物或前体化合物。本专利技术人首次提出建立以绿脓杆菌外排泵为靶点的高通量药物筛选模型，旨在从微生物的代谢产物中优选的以外排泵MexAB-OprM为靶点筛选抗耐药绿脓杆菌药物。所述筛选模型在国内、外的文献中均未见到相关的报道。具体的，在缺失外排系统的绿脓杆菌中克隆表达外排蛋白mexAB-oprM基因，构建过量表达MexAB-OprM蛋白的绿脓杆菌，以此作为检定菌建立高通量的药物筛选模型，筛选作用于MexAB-OprM的抗耐药绿脓药物。本专利技术的筛选模型克服了现有技术中通过大肠杆菌作为宿主表达外排蛋白所导致的外排底物谱发生改变，以及由于外膜通透性不同所带来的假阳性，具有极高的特异性。采用本专利技术所述筛选模型获得的抗耐药绿脓杆菌药物与目前临床上广泛应用的抗细菌药物具有完全不同的作用机制，可以大大降低绿脓杆菌对药物的先天抗性，克服由于外排作用导致的高度耐药绿脓杆菌，逆转其后天获得的抗性，使一大批因为绿脓杆菌的外排作用失去对相关感染的治疗功能的抗生素在临床应用中恢复应有的活性。
技术实现思路
本专利技术人针对绿脓杆菌的耐药机制，通过分子生物学方法，构建高效表达外排泵，特别是过量表达外膜蛋白MexAB-OprM的重组绿脓杆菌作为检定菌，成功建立了作用于绿脓杆菌外排系统之药物的高通量药物筛选模型。该模型能够用于从微生物代谢产物中筛选例如以外排泵MexAB-OprM为靶点的新型抗耐药绿脓杆菌药物。在本专利技术的一个实施方案中，涉及一种以绿脓杆菌外排泵例如外膜蛋白Mex AB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型。在本专利技术的一个实施方案中，提供了一种以外膜蛋白Mex AB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，其是通过以重组绿脓杆菌XY229(含有质粒pAK1900-mexAB-oprM)为检定茵，以刚好低于所述检定菌MIC值浓度的抗生素(MexAB-OprM的底物)为辅助抗生素，通过比较加入或不加入待测化合物后不同时间点于540nm测定的光吸收值，从待测样品中获得以外膜蛋白Mex AB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物。在本专利技术中，所述待测样品，包括但不限于，天然来源的样品和微生物发酵产物，和人工合成的化合物。本专利技术还涉及一种利用本专利技术上述筛选模型筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法，所述方法包括如下步骤1)在加入终浓度为100μg/ml的链霉素和100μg/ml的氨苄青霉素的MH培养基中，37℃，200rpm过夜培养接种含有重组质粒pAK1900-mexAB-oprM的重组绿脓杆菌作为检定茵；2)在96孔板中分别加入生长对照组(C)和样品筛选组(S)的样品，样品对照组(S’)，在540nm波长下分别检测生长对照组、样品对照组和样品筛选组样品的光吸收值，其中生长对照组的组成为MH液体培养基，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素以及1％的步骤1)中制备的检定菌过夜培养物；样品对照组的组成为MH液体培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以绿脓杆菌外排泵为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，其特征在于使用过量表达所述绿脓杆菌外排泵的重组绿脓杆菌为检定菌，以刚好低于所述检定菌ＭＩＣ值浓度的外排泵之底物抗生素为辅助抗生素，通过比较加入或不加入待测化合物后不同时间点于５４０ｎｍ测定的光吸收值，用于以绿脓杆菌外排泵为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖春玲，杨丽霞，田睿，姚天爵，刘艺霜，游雪甫，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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