本发明专利技术涉及一种藤黄绿菌素的发酵培养方法，采用能分泌藤黄绿菌素的假单胞菌菌种，在甘油培养基上连续传代５～６次，获得的发酵用假单胞菌菌株再接种到甘油培养液中生长及放大生产，在２８－３２℃、ｐＨ６．８－７．５，搅拌发酵或振荡培养３６－７２小时，得到的发酵液中藤黄绿菌素产量达到７００－９５０ｍｇ／Ｌ。利用本发明专利技术获得的藤黄绿菌素发酵液可配制不同浓度的杀菌剂，用于防治蔬菜疫病、棉花枯萎病、甜菜枯萎病、香蕉蔓枯病以及各种腐霉和疫霉引起的植物病害。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，得到稳定高产的藤黄绿菌素假单胞菌发酵液，用于配制不同浓度的杀菌剂，防治各种植物病害。属于生物农药
技术介绍
由于化学农药的长期不合理使用，使大量农药积累在土壤环境中，既污染了生态系统，也对农业生产的可持续发展造成不利影响，同时农产品中的农药有毒残留物对人体健康存在着潜在的危害。而生物农药具有安全可靠、不污染环境、对人畜的毒性较小以及不易产生抗药性等优点，对促进农业生产发展、维护生态环境起到了重要作用。植物根际促生细菌(Plant 6rowth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是当前农业微生物的研究热点之一。PGPR能通过多种方式促进植物生长，最重要的方式是分泌抗病物质抑制土壤中植物病原菌繁殖，控制植物病害发生。假单胞菌是其中典型代表，其生物防治的主要机理是它可以分泌一种或几种抗生物质来抑制病原菌的生长，假单胞菌产生的抗生素类型有吩嗪类抗生素、硝吡咯菌素、藤黄绿菌素、2，4-二乙酰藤黄酚等。其中藤黄绿菌素(Plt)是一种聚酮类化合物，国际上研究报道它对棉花枯萎病、甜菜枯萎病等有良好的防治效果，且安全性好。它有效防治甜椒疫病、香蕉蔓枯病等，并且无毒副作用。平板培养试验发现对其他疫霉属的真菌具有强烈抑制作用。藤黄绿菌素能够有效地抑制植物病原菌终极腐霉和黑根腐病病原菌，并且对离体辣椒果疫病的防病效果可达70％以上。许多假单胞菌菌株能分泌Plt，如荧光假单胞菌Pf-5，CHAO，S272，假单胞菌M18、GP72等。迄今为止，Plt的发酵产量报道最高的为420mg/L发酵液，Nakata等(PATENTNUMBERJP 2000069985)发现在只有乙醇做碳源的培养基上生长的荧光假单胞菌S272，可高产Plt，但离开Plt的商业化发酵要求仍有很大距离。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有藤黄绿菌素发酵产量较低的现状，提供一种，得到的发酵培养液中藤黄绿菌素的产量高而稳定，可用于制备微生物源农用抗菌制剂，有效控制植物真菌类病害。为实现这一目的，本专利技术采用能分泌藤黄绿菌素的假单胞菌菌种，在甘油培养基上连续传代若干次，获得的发酵用假单胞菌菌株再接种到甘油培养液中生长及放大生产，在一定条件下搅拌发酵或振荡培养，得到高产量的藤黄绿菌素发酵液。本专利技术的方法具体为1、发酵用假单胞菌菌株的准备取出冷冻保藏的能分泌藤黄绿菌素Plt的假单胞菌菌种，在甘油培养基的平板上28-32℃下接种活化生长18-24小时，继续挑选菌落在甘油培养基上连续传代5～6次，获得发酵用假单胞菌菌株备用。2、假单胞菌菌株发酵培养将发酵用假单胞菌菌株接种到含有甘油培养液的三角瓶中生长，再接种到含有甘油培养液的三角瓶或发酵罐中放大生产，在28-32℃、pH 6.8-7.5，在转速为150-300转/分的条件下搅拌发酵或振荡培养，发酵培养时间为36-72小时，得到藤黄绿菌素产量达到700-950mg/L的发酵液。其中，所述甘油培养基及甘油培养液是以甘油为主要碳源，添加无机盐磷酸氢二钾、硫酸镁配制而成。甘油培养基及甘油培养液中含有的组分重量百分比为甘油1.5-2.0，硫酸镁0.04-0.1，磷酸二氢钾0.02～0.08，氮源为蛋白胨1.8-2.4或黄豆粉2.0-4.0，其余成分为水，pH值为6.87.2。利用本专利技术制备的藤黄绿菌素发酵液经水稀释后制成杀菌剂，对植物进行喷雾或灌根施用，使用浓度为15毫克/升，亩用量0.3克，可以有效防治各种腐霉和疫霉等引起的多种植物病害，取得了50-80％以上的防治效果。本专利技术藤黄绿菌素发酵液中的含量可由以下方法确定取200μL假单胞菌发酵液，加入离心管中，再取200μL乙酸乙酯与之相混。以12000r/min的速率离心5min。在上层液体中取出100μL，42℃真空干燥15min。加入100μL甲醇溶解，取5μL进样，进行色谱分析。本专利技术制备的藤黄绿菌素发酵液具有以下优点1、其中的活性成分藤黄绿菌素的发酵含量较为稳定，发酵含量超过已见报道的一倍以上，达到700-950mg/L，易于配制不同浓度的杀菌剂。2、利用本专利技术藤黄绿菌素发酵液制备的杀菌剂可用于对植物进行喷雾或灌根施用，可防治蔬菜疫病、棉花枯萎病、甜菜枯萎病、香蕉蔓枯病，以及各种腐霉和疫霉引起的植物病害，有良好的防治效果，且安全性好。具体实施例方式以下通过具体的实施例对本专利技术的技术方案及技术效果作进一步描述。以下实施例不构成对本专利技术的限定。实施例1将产Plt的假单胞菌M18(CGMCC NO.0462)在甘油培养基的平板上28℃下接种活化生长18小时，继续挑选菌落在甘油培养基上连续传代6次。将传代稳定后的假单胞菌M18菌株接种到含有甘油培养液的250mL三角瓶中生长，再接种到含有甘油培养液的3L三角瓶中放大生产，在28℃、pH 7.0，摇床转速为250转/分，发酵培养72小时，Plt产量可达到850mg/L发酵液。其中甘油培养基及甘油培养液中含有的组分(wt％)为甘油1.8、蛋白胨2.0、硫酸镁0.05、磷酸二氢钾0.04，其余成分为水。调节pH为7.0。实施例2将产Plt的假单胞菌GP72(C6MCC，NO.1748)在甘油培养基的平板上28℃下接种活化生长24小时，继续挑选菌落在甘油培养基上连续传代5次。将传代稳定后的假单胞菌GP72菌株接种到含有甘油培养液的250mL三角瓶中生长，再接种到含有甘油培养液的1L三角瓶中放大生产，在28℃、pH 7.2，摇床转速为230转/分，发酵培养60小时，Plt产量可达到760mg/L发酵液。其中甘油培养基及甘油培养液中含有的组分(wt％)为甘油2.0、黄豆粉3.0、硫酸镁0.05、磷酸二氢钾0.05，其余成分为水。调节pH为7.2。实施例3将产Plt的假单胞菌M18(CGMCC NO.0462)在甘油培养基的平板上28℃下接种活化生长20小时，继续挑选菌落在甘油培养基上连续传代5次。将传代稳定后的假单胞菌M18菌株接种到含有甘油培养液的250mL三角瓶中生长，再接种到含有甘油培养液的3L三角瓶中放大生产，在30℃、pH 7.0，摇床转速为220转/分，发酵培养66小时，Plt产量可达到820mg/L发酵液。其中甘油培养基及甘油培养液中含有的组分(wt％)为甘油1.9、蛋白胨2.2、硫酸镁0.07、磷酸二氢钾0.05，其余成分为水。调节pH为7.0。权利要求1.一种，其特征在于包括如下步骤1)取出冷冻保藏的能分泌藤黄绿菌素的假单胞菌菌种，在甘油培养基的平板上28-32℃下接种活化生长18-24小时，继续挑选菌落在甘油培养基上连续传代5～6次，获得发酵用假单胞菌菌株备用；2)将发酵用假单胞菌菌株接种到含有甘油培养液的三角瓶中生长，再接种到含有甘油培养液的三角瓶或发酵罐中放大生产，在28-32℃、pH 6.8-7.5，转速为150-300转/分的条件下搅拌发酵或振荡培养，发酵培养时间为36-72小时，得到藤黄绿菌素产量达到700-950mg/L的藤黄绿菌素发酵液；其中，所述甘油培养基及甘油培养液中含有的组分重量百分比为甘油1.5-2.0，硫酸镁0.04-0.1，磷酸二氢钾0.02～0.08，蛋白胨1.8-2.4或黄豆粉2.0-4.0，其余成分为水，pH值为6.8-7.2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种藤黄绿菌素的发酵培养方法，其特征在于包括如下步骤：１）取出冷冻保藏的能分泌藤黄绿菌素的假单胞菌菌种，在甘油培养基的平板上２８－３２℃下接种活化生长１８－２４小时，继续挑选菌落在甘油培养基上连续传代５～６次，获得发酵用假单胞菌菌株 备用；２）将发酵用假单胞菌菌株接种到含有甘油培养液的三角瓶中生长，再接种到含有甘油培养液的三角瓶或发酵罐中放大生产，在２８－３２℃、ｐＨ６．８－７．５，转速为１５０－３００转／分的条件下搅拌发酵或振荡培养，发酵培养时间为３６－７２小 时，得到藤黄绿菌素产量达到７００－９５０ｍｇ／Ｌ的藤黄绿菌素发酵液；其中，所述甘油培养基及甘油培养液中含有的组分重量百分比为：甘油１．５－２．０，硫酸镁０．０４－０．１，磷酸二氢钾０．０２～０．０８，蛋白胨１．８－２．４或黄豆粉２．０－４．０，其余成分为水，ｐＨ值为６．８－７．２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张雪洪，胡洪波，许煜泉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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