一种ERK和JNK信号通路抑制剂Mce2E制造技术

本发明专利技术公开了一种ERK和JNK信号通路抑制剂Mce2E，属于细胞生物学领域。本发明专利技术公开Mce2E可以通过“RTLASVALIL”模序与ERK和JNK蛋白相互作用抑制它们的磷酸化，并且通过空间调控使ERK1/2和JNK蛋白定位于内质网中阻止其入核，最终实现对ERK和JNK信号通路的抑制作用。本发明专利技术成果可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，也可以直接应用于科研领域或指导开发ERK1/2和JNK的抑制剂。此外，该成果还对寻找新的药物靶点和筛选新药具有重要的理论意义。

A ERK and JNK signaling pathway inhibitor Mce2E

The invention discloses a ERK and JNK signaling pathway inhibitor Mce2E, which belongs to the field of cell biology. The present invention discloses that Mce2E can inhibit their phosphorylation through the interaction of RTLASVALIL and ERK and JNK protein, and make ERK1/2 and JNK proteins located in the endoplasmic reticulum through space control to prevent their nucleation, and finally achieve the inhibition of ERK and JNK signaling pathways. The results of the invention can provide new tools and ideas for the treatment of various diseases in the clinic, and can also be applied directly to scientific research, or to develop inhibitors of ERK1/2 and JNK. In addition, the results also have important theoretical significance for finding new drug targets and screening new drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种ERK和JNK信号通路抑制剂Mce2E
本专利技术涉及一种ERK和JNK信号通路抑制剂Mce2E，是一种能同时抑制ERK和JNK信号通路的结核分枝杆菌分泌蛋白，属于细胞生物学领域。
技术介绍
结核分枝杆菌是一种兼性胞内致病菌，以巨噬细胞为主要的宿主细胞，并在其中存活和生长。哺乳动物细胞入侵蛋白(mammaliancellentry，Mce)Mce是由mce基因编码的一组分泌或者膜表面粘附蛋白，已被证明具有促进分枝杆菌入侵宿主细胞的功能。其中mce2操纵子就与分枝杆菌的毒力和肉芽肿形成有关，但是，mce2操纵子编码的Mce2E蛋白在炎症和免疫相关信号通路的相关功能尚不清楚。c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)p42/p44通路属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)信号转导通路。因此，ERK和JNK信号通路是正常与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。JNK信号通路在细胞应激中发挥重要作用。目前，JNK的研究与肥胖和胰岛素抵抗有密切关系，具体的分子机制研究也比较清楚。越来越多的证据表明JNK1和JNK2的活化能促进肥胖和胰岛素抵抗的发展，在特定的疾病发展阶段，JNK引起的细胞应激与肥胖和二型糖尿病有关。ERK1/2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通常与细胞生长和增殖有关。分子量分别为44kD和42kD的蛋白，二者之间有90％的同源性。在静止的细胞中，ERK通过与各种锚定蛋白(包括MEK)的相互作用被固定在细胞质中，当细胞受到刺激，ERK1/2通路被激活后，p-ERK1/2由于构象的变化脱离锚定蛋白，相关的研究表明，ERK1/2信号通路的活性与炎症反应、肝脏疾病、肥胖症和糖尿病等代谢性疾病，尤其是ERK信号的激活能够促进肿瘤的发展。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种ERK和/或JNK信号通路抑制剂，可以抑制ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化，并且通过与ERK1/2和JNK相互作用使其定位于内质网无法入核，从而抑制了ERK和JNK信号通路的活化。所述抑制剂含有氨基酸序列包括如以下(a)或(b)或(c)所示氨基酸序列的多肽或蛋白质作为活性成分：(a)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有结合Erk1/2活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物；或者，含有氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽作为活性成分。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供所述抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)构建含有编码SEQIDNO.1所示蛋白的基因的重组质粒pGEX-6P-1-Mce2E，并将质粒转化到大肠杆菌中进行表达；(2)收集菌体，破碎后离心收取上清液，将上清液流过填充好的Glutathione-Sepharosebeads中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有谷胱甘肽的洗脱液洗脱蛋白，将收集的洗脱液加入到10kD的蛋白浓缩管中，离心浓缩；(3)在蛋白浓缩管中加入PBS混匀后离心、分装蛋白，-80℃保存待用。本专利技术发现SEQIDNO.1所示蛋白(Mce2E)中的关键模序RTLASVALIL可与ERK和JNK相互作用。进一步研究发现Mce2E定位在内质网，并通过与ERK和JNK的直接互作将其隔离到内质网，从而阻止ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化及入核。本专利技术找到了可以抑制ERK和JNK信号通路的SEQIDNO.1所示蛋白及其关键模序。由于ERK和JNK信号通路与多种疾病的发生，发展有密切相关，因此抑制这两种信号通路的活化这对于很多疾病都有控制作用。本专利技术成果将来可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，也可以直接应用于科研领域或指导开发ERK1/2和JNK通路的抑制剂。附图说明图1：(A)Mce2E能抑制ERK信号通路；(B)Mce2E抑制JNK信号通路；图2：(A)Mce2E与ERK2相互作用，阻断ERK与上游信号MEK1的作用，抑制ERK信号通路；(B)Mce2E与JNK1相互作用，阻断Mce2E与上游信号通路MMK4的作用，抑制JNK信号通路；图3：Mce2E主要通过模序RTLASVALIL抑制ERK和JNK信号通路；图4：(A)Mce2E将ERK隔离到内质网，阻止ERK入核；(B)Mce2E将JNK隔离到内质网，从而阻止JNK入核；具体实施方式实施例1结核分枝杆菌分泌蛋白Mce2E结核分枝杆菌分泌蛋白Mce2E，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。Mce2E及其结构类似物可用于ERK1/2和JNK活性抑制剂的开发。ERK2基因序列如GeneID:5594所示，JNK1基因序列如GeneID:5602所示。实施例2Mce2E能够抑制ERK和JNK通路的活化(A)采用双荧光报告基因技术检测Mce2E对ERK1/2通路活化的影响1)构建含有编码Mce2E基因的重组质粒pcDNA6A-Mce2E；2)构建含有编码MEK1-ED基因的重组质粒pCS2HA-MEK1-ED，采用重叠延伸PCR法将MEK1蛋白中的218位丝氨酸以及222位丝氨酸分别突变为谷氨酸和天冬氨酸后获得MEK1-ED基因片段；3)采用磷酸钙转染法将重组质粒pcDNA6A、pcDNA6A-Mce2E和检测ERK通路活化情况的质粒pGal4-Elk(0.6μg)、pGal4-luc(0.6μg)、pRL-TK(50ng)(购买自Promega公司)以及表达ERK1/2通路组成型激活剂的pCS2HA-MEK1-ED转染进293T细胞；4)转染6h后换新鲜培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量仪检测Mce2E对ERK通路活化的影响。(B)采用双荧光报告基因技术检测Mce2E对JNK通路活化的影响1)采用磷酸钙转染法将重组质粒pcDNA6A、pcDNA6A-Mce2E和检测JNK通路活化情况的质粒pFA-cJun(0.3μg),pGal4-luc(0.9μg),pRL-TK(50ng)(购买自Promega公司)以及表达JNK通路组成型激活剂RacL61的质粒转染进293T细胞；2)转染6h后换新鲜培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量仪检测Mce2E对JNK通路活化的影响。(C)实验结果分析双荧光报告基因实验结果表明Elk的活性明显降低，从而揭示ERK活化收到抑制，Mce2E可以显著抑制由MEK1-ED激活的ERK通路(见图1A)；AP-1的活性明显降低，从而揭示JNK活化收到抑制，Mce2E可以显著抑制RacL61激活的JNK通路(见图1B)；因此Mce2E是同时抑制ERK1/2和JNK信号通路的活化。实施例3Mce2E蛋白能够与ERK2和JNK蛋白互作，并抑制ERK和JNK的磷酸化(A)Mce2E和ERK2相互作用，阻断ERK2与MEK1相互作用。1)构建含有ERK2(GeneID:5594)基因的重组质粒p3XFlag-CMV14-ERK2和含有MEK1(GeneID:5604)基因的重组质粒pCDNA6A-MEK本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ERK和JNK信号通路抑制剂，其特征在于，含有氨基酸序列包括如以下(a)或(b)或(c)所示氨基酸序列的多肽或蛋白质作为活性成分：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有磷酸酯酶活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。

【技术特征摘要】
1.一种ERK和JNK信号通路抑制剂，其特征在于，含有氨基酸序列包括如以下(a)或(b)或(c)所示氨基酸序列的多肽或蛋白质作为活性成分：(a)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有磷酸酯酶活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。2.一种ERK和/或JNK信号通路抑制剂，其特征在于，含有氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽作为活性成分。3.一种ERK或JNK信号通路抑制剂，其特征在于，含有氨基酸序列包括如以下(a)或(b)或(c)所示氨基酸序列的多肽或蛋白质作为活性成分：(a)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有磷酸酯酶活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。4.权利要求1～3任一所述抑制剂在制备用于治疗ERK和/或JNK信号通路相关疾病的药物中的应用。5.治疗ERK和/或JNK信号通路相关疾病的药物，其特征在于，含有氨基酸序列包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠华，强丽华，汪静，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11