艾杜糖‑2‑硫酸酯酶的纯化制造技术

本发明专利技术除其它事项以外提供了用于纯化重组产生以用于酶替代疗法的I2S蛋白的改进方法。本发明专利技术部分地基于以下令人惊讶的发现，即可使用包括少至4个色谱柱的工艺从未经处理的生物材料例如含I2S的细胞培养基纯化重组I2S蛋白。

Purification of 2 iduronate sulfatase

In addition to other matters, the invention provides an improved method for purification of recombinant I2S protein for enzyme substitution therapy. Based on the following surprising findings, the invention can be used to process recombinant I2S protein, including less than 4 chromatographic columns, and never treated biological material, such as I2S containing cell culture medium.

【技术实现步骤摘要】
艾杜糖-2-硫酸酯酶的纯化相关申请的交叉引用本申请是申请号为201380042665.2、申请日为2013年6月28日、专利技术名称为“艾杜糖-2-硫酸酯酶的纯化”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2013/048561的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2012年6月29日，申请系列号为61/666,733的美国临时专利申请的优先权，其完整内容在此通过引用并入。序列表在本说明书提及在2013年6月27日以电子形式提交的命名为“2006685-0342_SEQ_LIST”的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日产生，并且大小为15KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。背景粘多糖贮积症II型(MPSII，亨特综合症)是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的缺乏而引起的X染色体连锁隐性溶酶体贮积症。I2S从葡糖氨基聚糖(GAG)硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素切割末端2-O-硫酸酯部分。由于亨特综合症患者中丧失I2S酶或存在有缺陷的I2S酶，因此GAG在多种细胞类型的溶酶体中逐渐累积，从而导致细胞肿胀，器官肿大，组织破坏和器官系统功能障碍。一般而言，具有亨特综合症的人的身体表现包括躯体和神经症状。例如，在亨特综合症的一些病例中，中枢神经系统受累导致发育迟缓和神经系统的问题。而亨特综合症的非神经症状在出生时一般不存在，随着时间的推移，GAG在体内细胞中的渐进累积可能对身体的外周组织具有巨大影响。GAG在外周组织中的累积导致患者面部特征的鲜明粗糙度，并且造成前额突出、扁平桥和巨舌，此为亨特综合征患者的最典型特征。类似地，GAG的累积可不利地影响身体的器官系统。最初表现为心脏、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和肾的异常肿大，这些深刻的变化最终可导致广泛的灾难性器官衰竭。因此，亨特综合症总是严重的、进行性的和限制寿命的。酶替代疗法(ERT)是用于治疗亨特综合症(MPSII)的批准的疗法，其包括向亨特综合症患者施用外源替代I2S酶。专利技术概述本专利技术除其它事项以外提供了用于纯化重组产生以用于酶替代疗法的I2S蛋白的改进方法。本专利技术部分地基于以下令人惊讶的发现，即可使用包括少至4个色谱柱的工艺从未经处理的生物材料例如含I2S的细胞培养基纯化重组I2S蛋白。用于酶替代疗法的重组I2S的批准现有的纯化工艺包括6个色谱柱。如在实施例部分中描述的，使用根据本专利技术的4柱工艺纯化的重组I2S蛋白符合美国和许多其他国家的市场营销纯度要求。此外，根据本专利技术纯化的重组I2S酶保留高百分比的Cα-甲酰甘氨酸(FGly)(例如，高于70％并高达100％)(这对于I2S酶的活性是重要的)和明显的特性例如唾液酸含量和聚糖图谱(这可促进重组I2S蛋白的生物利用度和/或溶酶体靶向)。因此，本专利技术提供了有效的、更廉价且更快速的用于纯化重组I2S蛋白的工艺。本专利技术特别适用于纯化在无血清培养基中产生的重组I2S蛋白。因此，在一个方面，本专利技术提供了使用基于阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种的工艺从不纯制剂纯化重组I2S蛋白的方法。在一些实施方案中，根据本专利技术的专利技术方法包括少于6个(例如，少于5个，少于4个或少于3个)色谱步骤。在一些实施方案中，根据本专利技术的专利技术方法包括2、3、4或5个色谱步骤。在一些实施方案中，根据本专利技术的专利技术方法包括4个色谱步骤。在一些实施方案中，根据本专利技术的纯化的重组I2S蛋白含有小于100ng/mg的宿主细胞蛋白质(HCP)(例如，小于90ng/mg的HCP、小于80ng/mg的HCP、小于70ng/mg的HCP、小于60ng/mg的HCP、小于50ng/mg的HCP、小于40ng/mg的HCP、小于30ng/mg的HCP、小于20ng/mg的HCP、小于10ng/mg的HCP)。在一些实施方案中，合适的阴离子交换色谱为Q色谱。在一些实施方案中，合适的阳离子交换色谱为SP色谱。在一些实施方案中，适合的混合模式色谱为羟基磷灰石(HA)色谱。在一些实施方案中，合适的疏水相互作用色谱为苯基色谱。预期阴离子交换色谱(例如，O柱)、阳离子交换色谱(例如，SP柱)、混合模式色谱(例如，HA柱)以及疏水相互作用色谱(例如，苯基柱)可以以任何顺序进行。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法按照该顺序进行阴离子交换色谱(例如，O柱)、阳离子交换色谱(例如，SP柱)、混合模式色谱(例如，HA柱)以及疏水相互作用色谱(例如，苯基柱)。在一些实施方案中，在上样至阴离子交换色谱柱(例如，Q柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液(flow-through)调整至约5.0-7.0(例如，约5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)的pH以及约10-20mS/cm(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mS/cm)的电导率。在一些实施方案中，使用1M醋酸钠调整pH。在一些实施方案中，使用5M氯化钠调整电导率。在一些实施方案中，上样后，使用pH为约5.0-7.0(例如，约5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)的包含在约140mM至200mM(例如，约140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM)的范围内的盐(例如，NaCl)浓度的洗涤缓冲液洗涤阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，使用包含线性盐(例如，NaCl)梯度的洗脱缓冲液洗脱阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，适当的线性NaCl梯度含有在约0-500mM范围内的NaCl(例如，约0-400mM、约0-350mM、约0-300mM、约50-500mM、约150-500mM、约150-450mM、约150-400mM)。在一些实施方案中，在上样至阳离子交换色谱柱(例如，SP柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约1mS/cm与20mS/cm之间(例如，约1mS/cm与15mS/cm之间、约1mS/cm与10mS/cm之间、约1mS/cm与8mS/cm之间、约1mS/cm与6mS/cm之间、约1mS/cm与4mS/cm之间、约2mS/cm与4mS/cm)的范围内的电导率。在一些实施方案中，在上样至阳离子交换色谱柱(例如，SP柱)之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约2mS/cm与4mS/cm之间(例如，2、2.5、3、3.5或4mS/cm)的范围内的电导率。在一些实施方案中，通过用H2O以约1-2:1(例如，1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1)的比率从阴离子交换色谱柱稀释洗脱液来调整电导率。在一些实施方案中，通过渗滤调整电导率。在一些实施方案中，在约5.0-6.5(例如，约5.0、5.5、6.0或6.5)的pH下运行阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，利用包含在约0.01M至约0.1M(例如，约0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M或0.1M)的范围内的磷酸盐(例如，NaPO4)浓度的缓冲液运行阳离子交换色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含纯化的重组艾杜‑2‑硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖‑2‑硫酸酯酶具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQ ID NO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα‑甲酰甘氨酸(FGly)的转化，其中所述纯化的重组I2S含有小于150ng/mg的宿主细胞蛋白质(HCP)。

【技术特征摘要】
2012.06.29 US 61/666,7331.一种包含纯化的重组艾杜-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQIDNO:1相同的氨基酸序列，其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQIDNO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，其中所述纯化的重组I2S含有小于150ng/mg的宿主细胞蛋白质(HCP)。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有至少75％的对应于SEQIDNO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有至少85％的对应于SEQIDNO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。4.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQIDNO:1相同的氨基酸序列，其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQIDNO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，和其中所述纯化的重组I2S含有每分子酶至少10％的二磷酸化寡糖。5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有每分子酶至少50％的二磷酸化寡糖。6.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸酯酶具有与SEQIDNO:1相同的氨基酸序列，其中所述纯化的重组I2S包含至少70％的对应于SEQIDNO:1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Cα-甲酰甘氨酸(FGly)的转化，和其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少40U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少50U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少60U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。9.一种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·尼科尔斯，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US