分离纯化肿瘤细胞的方法及试剂盒技术

一种分离纯化肿瘤细胞用试剂盒，包括：制备肿瘤细胞悬浮液的消化剂，用于悬浮肿瘤细胞的悬浮剂，包含在分离容器中用于肿瘤细胞分离纯化的分离剂和用于过滤消化后细胞的细胞滤器。所述消化剂的成分包括：胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅳ或它们的混合物，所述悬浮液的成分包括：稳定细胞环境ｐＨ值的缓冲剂，所述分离剂的比重介于：１．０２０－１．０２５之间，其成分包括无机盐、氨基酸、维生素和细胞因子，所述分离容器包括容量介于１５ｍｌ－５０ｍｌ的试管／离心管，所述细胞滤器的孔径为７０－１００μｍ。采用该试剂盒，可快速简便、兼容性好、所获细胞纯度高、成活率高、分离纯化成本低并且安全地实现肿瘤细胞的分离纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分离纯化肿瘤细胞的方法和试剂盒。特别涉及用于肿瘤病理组织块、恶性胸水、腹水等体腔积液、脑积液中肿瘤细胞的分离纯化方法和实现该方法的试剂盒。
技术介绍
获得纯化的肿瘤细胞对于进行肿瘤疾病的分子生物学研究、疾病机制研究和疾病治疗研究均十分重要。但是由于肿瘤细胞总是与非肿瘤细胞如淋巴细胞、成纤维细胞、间质细胞和肿瘤坏死细胞联系在一起，因此，普通的细胞分离方法难于获得高纯度的肿瘤细胞。现有技术中已有关于肿瘤细胞分离纯化的公开报道，例如马吉勇，王明丽等《安徽医科大学学报》，2002，37(2)，132-134页，描述了采用密度梯度离心法和不连续密度梯度离心法分别分离纯化恶性胸水中的肿瘤细胞，其细胞染色后的阳性率分别为45％和65％。姜玉章，《陕西医学检验》，1997，12(2)，25-26页，描述了三步低速离心纯化肿瘤细胞的方法，通过对体腔积液的离心分离，细胞学阳性率为88.3％。以上提到的分离纯化方法由于离心力控制不够，所得到的肿瘤细胞的可培养性较差，成活率低。另外，也有利用反式分离的方法，例如高振强，郑杰，《癌症》1997，16(2)，156-157页，用高效价的抗血清特异性杀伤杂系细胞，从而获得纯系肿瘤细胞；朱佑明，张希衡，《上海第二医科大学学报》，1995，15(2)，144-146页，利用肿瘤细胞的粘附、贴壁特性，在培养过程中多次移孔将杂细胞清除。上述的两种方法由于前者需要使用附加的抗体使得其应用性大为降低，而后者由于耗时较长，过程难于控制，因此只能在少数肿瘤细胞的分离中实用。另外，中国专利申请03146933.7中公开了作为分离纯化介质的人血清和胎牛血清，由于使用血清进行分离纯化涉及使用者的安全问题，例如血清中的残留病毒或交叉污染等问题。另外，血清在使用前需要进行热灭活以除去对细胞有影响的补体成分，所以在分离介质中使用非血清成分作为分离纯化的介质就显得十分必要。可见，在肿瘤疾病的分子生物学研究、疾病机制研究和疾病治疗研究领域，迫切需要一种快速简便、兼容性好，所获细胞纯度高，成活率高、分离纯化成本低、使用安全的肿瘤细胞分离方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于避免现有技术的不足，而寻求一种快速简便、兼容性好，所获细胞纯度高，成活率高、分离纯化成本低、使用安全的肿瘤细胞分离方法，并进一步地制备实现该方法的试剂盒。本专利技术解决上述技术问题采用的技术方案包括，提出一种分离纯化肿瘤细胞的方法，包括以下步骤①.制备肿瘤细胞悬浮液如果采用肿瘤组织块，使用消化剂在一定温度条件下处理一预定时间形成细胞消化液，再将该细胞消化液通过细胞滤器过滤，即得含肿瘤细胞的悬浮液；如果采用肿瘤腔间积液，则将该腔间积液直接通过细胞滤器过滤，收集细胞滤过液，加入悬浮液与这些细胞滤过液混匀，即得含肿瘤细胞的悬浮液；②.在第一容器中加入分离剂，并将所述含肿瘤细胞的悬浮液加到该容器中的分离剂的顶部；③.将所述第一容器竖直静置一预定时间后，于该容器的底端处取出一预定体积比例的含肿瘤细胞的分离剂，并置于第二容器中；④.将所述盛有含肿瘤细胞的分离剂的第二容器进行离心处理，去除上清，沉淀部分即为纯化的肿瘤细胞。在步骤①中，所述的一定温度指37℃，所述的一预定时间指3-4小时。在步骤③中，所述的一预定时间指2-15分钟，优选为4-10分钟，最优选为6分钟。在步骤③中，所述的一预定体积比例指2.5-37.5％，优选为7.5-25％，最优选为15％。本专利技术解决上述技术问题采用的技术方案还包括，生产制造一种实现上述方法的分离纯化肿瘤细胞用试剂盒，包括制备肿瘤细胞悬浮液的消化剂，用于悬浮肿瘤细胞的悬浮剂，包含在分离容器中用于肿瘤细胞分离纯化的分离剂和用于过滤消化后细胞的细胞滤器。所述消化剂的成分包括胰蛋白酶、胶原酶I、胶原酶IV或它们的混合物，优选地包括等比例的胰蛋白酶与胶原酶I或胰蛋白酶与胶原酶IV。所述消化剂中各酶的浓度范围0.1-3mg/ml，优选的浓度范围0.5-1.5mg/ml，最优选的浓度范围0.75-1mg/ml。所述悬浮液的成分包括稳定细胞环境PH值的缓冲剂，优选地包括磷酸盐缓冲液或Hank’s平衡盐缓冲液，和RPMI 1640培养液。所述分离剂的比重介于1.020-1.025之间，其成分包括无机盐、氨基酸、维生素和细胞因子。所述分离容器包括容量介于5ml-250ml的试管/离心管，优选包括容量介于10ml-100ml的试管/离心管，最优选包括容量介于15ml-50ml的试管/离心管。所述细胞滤器的孔径为10-200μm，优选50-150μm，最优选70-100μm。同现有技术相比，采用本专利技术的分离纯化肿瘤细胞的方法及试剂盒，可快速简便、兼容性好、所获细胞纯度高、成活率高、分离纯化成本低并且安全地实现肿瘤细胞的分离纯化。具体实施例方式以下结合具体实施例对本
技术实现思路
予以进一步详尽说明。本专利技术研究人员发现，肿瘤细胞与正常生理状态的细胞相比，其细胞核与细胞质的比例大大高于正常细胞中两者的比例。因此基于肿瘤细胞的核质比可进行分离纯化。进一步的研究表明，如前所述，现有技术中的离心分离法易损伤细胞，而抗体选择法和移孔法也受限于诸多因素。因此，本专利技术通过将肿瘤细胞悬浮液(含有其它各种非肿瘤细胞)柔性通过预定高度的本专利技术分离纯化介质，并通过低速离心沉淀所需的肿瘤细胞而实现了肿瘤细胞的分离。本专利技术提供一组用于肿瘤细胞分离纯化的试剂组合物。所述组合物包括下列组分(1)含多种酶的肿瘤组织消化剂。其中酶是胰蛋白酶、胶原酶I、胶原酶IV或/和它们的混合物。优选为胰蛋白酶与胶原酶I或胶原酶IV的等比例混合物。每种酶的浓度介于0.1-3mg/ml之间，优选0.5-1.5mg/ml，最优选0.75-1mg/ml。(2)用于悬浮肿瘤细胞的悬浮剂。所述悬浮剂含有稳定细胞环境pH的缓冲剂。优选的悬浮剂可以是磷酸盐缓冲液、Hank’s平衡盐缓冲液和RPMI 1640培养液等。(3)用于肿瘤细胞分离纯化的分离剂，所述分离剂含有维持细胞生长性能的氨基酸、维生素和多种细胞因子等，参见下表I。比重介于1.020-1.025之间。表I肿瘤细胞分离剂组成 本专利技术还提供一种用于肿瘤细胞分离纯化的方法。所述方法包括柔性的分离纯化流程，该流程包括下列步骤(1)制备肿瘤细胞悬浮液；如果必要，使用消化剂在37℃处理组织块3-4小时形成细胞消化液，肿瘤组织消化剂可由含多种酶例如胰蛋白酶、胶原酶I、胶原酶IV或/和它们的混合物等组成。优选为胰蛋白酶与胶原酶I或胶原酶IV的等比例混合物。每种酶的浓度介于0.1-3mg/ml之间，优选0.5-1.5mg/ml，最优选0.75-1mg/ml。将该细胞消化液通过细胞滤器过滤，形成含肿瘤细胞的悬浮液。细胞滤器的孔径通常为10-200μm，优选50-150μm，最优选70-100μm。(2)将所得肿瘤组织细胞悬浮液加在装于容器中的分离剂顶部；(3)将所述容器直立静置一预定时间后，紧贴容器底部取出预定体积的含肿瘤细胞的分离剂，并置于另一容器中；该预定时间优选为2-15分钟，更优选为4-10分钟，最优选为6分钟。(4)将该容器低速离心处理后，去除上清部分，沉淀部分即为纯化的肿瘤细胞。本专利技术还提供依据本专利技术的组合物和方法制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①．制备肿瘤细胞悬浮液：如果采用肿瘤组织块，使用消化剂在一定温度条件下处理一预定时间形成细胞消化液，再将该细胞消化液通过细胞滤器过滤，即得含肿瘤细胞的悬浮液；如果采用肿瘤腔间积液 ，则将该腔间积液直接通过细胞滤器过滤，收集细胞滤过液，加入悬浮液与这些细胞滤过液混匀，即得含肿瘤细胞的悬浮液；②．在第一容器中加入分离剂，并将所述含肿瘤细胞的悬浮液加到该容器中的分离剂的顶部；③．将所述第一容器竖直静置一预定 时间后，于该容器的底端处取出一预定体积比例的含肿瘤细胞的分离剂，并置于第二容器中；④．将所述盛有含肿瘤细胞的分离剂的第二容器进行离心处理，去除上清，沉淀部分即为纯化的肿瘤细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁培华，曹雯雯，丁野青，杜纲国，魏球英，
申请(专利权)人：深圳依诺金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]