重组酶聚合酶扩增试剂盒、扩增方法及扩增试剂技术

本发明专利技术涉及一种重组酶聚合酶扩增试剂盒，包括：Ecoli RecA蛋白；λ phage Orf蛋白；Ecoli SSB蛋白及DNA聚合酶；本发明专利技术还提供了一种重组酶聚合酶扩增方法及扩增试剂。本发明专利技术的重组酶聚合酶扩增试剂盒，采用Ecoli RecA蛋白、Ecoli SSB蛋白及λ phage Orf蛋白协同作用的扩增体系，扩展了重组酶聚合酶扩增的应用范围；与传统PCR技术相比，本发明专利技术的重组酶聚合酶扩增反应在恒温条件下即可进行，无需PCR仪等温度循环仪器，不受实验空间限制；本发明专利技术的扩增反应在10至60分钟即可完成，远快于PCR技术或其他等温扩增技术。

Recombinant enzyme PCR amplification kit, amplification method and amplification reagent

The invention relates to a recombinase polymerase amplification kit, including: Ecoli phage lambda RecA protein; Orf protein; Ecoli protein SSB and DNA polymerase; the invention also provides a recombinase polymerase amplification method and amplification reagent. The invention of the recombinase polymerase amplification kit, amplified by Ecoli system synergetic effect of RecA protein, SSB protein and Ecoli lambda phage Orf protein, and expanded the range of application of recombinase polymerase amplification; compared with the traditional PCR technology, the invention of the recombinase polymerase extension increase reaction can be carried out under constant temperature condition no, PCR instrument of temperature cycling is not affected by the experimental instrument, the invention of the space limitation; complete the amplification reaction in 10 to 60 minutes, much faster than PCR or other isothermal amplification technology.

【技术实现步骤摘要】
重组酶聚合酶扩增试剂盒、扩增方法及扩增试剂
本专利技术涉及一种恒温扩增技术，更具体地说，涉及一种重组酶聚合酶扩增（RPA）试剂盒、扩增方法及扩增试剂。
技术介绍
传统的体外DNA扩增主要是采用聚合酶链式反应（PCR）的方法，目前已经广泛应用于生物医学等领域。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：（1）模板DNA的变性，模板DNA经加热至90-95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；（2）模板DNA与引物的退火，模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55-60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸，DNA模板—引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75℃条件下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术的优点显而易见，但由于其需要精密的温度循环仪器才能完成扩增过程，对仪器的依赖程度较高，加之成本高、反应耗时长，这些局限性使其应用大多限制于条件良好的实验室内，难以广泛应用于现场检测。因此，需要一种提供不依赖于PCR仪等温度循环仪器的扩增方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组酶聚合酶扩增试剂盒、扩增方法及扩增试剂，在恒温条件下实现对特定核酸序列的高效扩增，使得核酸扩增的过程可以直接在无需PCR仪等温度循环仪器的条件下完成。本专利技术提供了一种重组酶聚合酶扩增试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：EcoliRecA蛋白、λphageOrf蛋白、EcoliSSB蛋白及DNA聚合酶。优选的，所述试剂盒还包括扩增反应缓冲液，所述扩增反应缓冲液包括Tris缓冲液，所述扩增反应缓冲液还包括聚乙二醇、二硫苏糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一种或多种。优选的，所述试剂盒还包括镁离子制剂。本专利技术还提供了一种重组酶聚合酶扩增方法，所述方法包括以下步骤：A、配置反应体系，所述反应体系包括：模板核酸分子、引物组、EcoliRecA蛋白、λphageOrf蛋白、EcoliSSB蛋白、DNA聚合酶、dNTP、ATP及扩增反应缓冲液，所述扩增反应缓冲液包括Tris缓冲液；B、向所述反应体系中加入镁离子制剂；C、在20至65℃条件下进行扩增反应。优选的，所述扩增反应缓冲液还包括聚乙二醇、二硫苏糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一种或多种。优选的，所述引物组包括一对引物，所述引物的长度为30至65bp。优选的，所述EcoliRecA蛋白浓度为20至250ng/μL；所述λphageOrf蛋白浓度为20至80ng/μL；所述EcoliSSB蛋白的浓度为200至1000ng/μL。本专利技术还提供了一种重组酶聚合酶扩增试剂，所述试剂包括：EcoliRecA蛋白、λphageOrf蛋白、EcoliSSB蛋白及DNA聚合酶。优选的，所述扩增试剂还包括扩增反应缓冲液，所述扩增反应缓冲液包括Tris缓冲液；所述扩增反应缓冲液还包括聚乙二醇、二硫苏糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一种或多种。优选的，所述EcoliRecA蛋白浓度为20至250ng/μL；所述EcoliSSB蛋白浓度为200至1000ng/μL；所述λphageOrf蛋白浓度为20至80ng/μL。本专利技术的重组酶聚合酶扩增试剂盒，采用EcoliRecA蛋白、EcoliSSB蛋白及λphageOrf蛋白协同作用的扩增体系，扩展了重组酶聚合酶扩增的应用范围；与传统PCR技术相比，本专利技术的重组酶聚合酶扩增反应在恒温条件下即可进行，无需PCR仪等温度循环仪器，不受实验空间限制；本专利技术的扩增反应在10至60分钟即可完成，远快于PCR技术或其他等温扩增技术。附图说明图1是第一具体实施例中重组酶聚合酶扩增及对照PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图。图2是第二具体实施例中重组酶聚合酶扩增的毛细管电泳检测图。图3是第三具体实施例中重组酶聚合酶扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图。图4是第四具体实施例中重组酶聚合酶扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术提出第一实施例，一种重组酶聚合酶扩增试剂盒，包括以下组分：EcoliRecA蛋白、λphageOrf蛋白、EcoliSSB蛋白及DNA聚合酶。需要说明的是，本专利技术的重组酶聚合酶扩增是基于生物体内同源重组原理的恒温扩增技术：在适宜温度下，重组酶EcoliRecA蛋白和λphageOrf蛋白共同作用，与引物结合形成酶和引物的复合体，复合体定位到模板核酸分子同源靶序列上并形成链置换；单链结合蛋白与被置换的核苷酸链结合，防止进一步置换；在DNA聚合酶的作用下启动DNA链合成，对模板核酸分子上的目标区域进行扩增。本专利技术重组酶聚合酶扩增试剂盒中，所述EcoliRecA蛋白和EcoliSSB蛋白来源于大肠杆菌，λphageOrf蛋白来源于λ噬菌体。本专利技术的λphageOrf蛋白与EcoliRecA蛋白和EcoliSSB蛋白的种属来源不同，但可以在同一体系中共同作用并实现重组酶聚合酶扩增，从而大大扩展了重组酶聚合酶扩增技术的应用范围。需要说明的是，本文所称的“来源”仅指其种类，而不是指蛋白的制备来源。本专利技术一实施方式中，所述DNA聚合酶优选为在20至65℃条件下有链置换活性的DNA聚合酶。本专利技术一实施方式中，所述DNA聚合酶优选为SauDNA聚合酶、BsuDNA聚合酶或BstDNA聚合酶。本专利技术一实施方式中，所述试剂盒还包括dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等摩尔比混合液；在扩增过程中，所述dNTP用作DNA链合成的底物。本专利技术一实施方式中，所述试剂盒还包括ATP；在扩增过程中，所述ATP为模板核酸分子和复合体之间的链置换过程提供能量。本专利技术一实施方式中，所述试剂盒还包括扩增反应缓冲液，所述扩增反应缓冲液包括Tris缓冲液；所述Tris缓冲液用于维持反应体系的pH值。本专利技术一实施方式中，所述扩增反应缓冲液还包括聚乙二醇；向反应体系中加入聚乙二醇后，聚乙二醇作为高分子物质，占据了反应体系中体积的很大部分，同时排斥其他组分进入此空间，从而使得扩增体系中其他组分更充分地接触，进而提高扩增效率。本专利技术一实施方式中，所述聚乙二醇的平均分子量为3000至20000；该分子量范围内的聚乙二醇，对反应体系中其他组分的排斥作用更明显。本专利技术一实施方式中，所述扩增反应缓冲液还包括二硫苏糖醇；所述二硫苏糖醇可以有效防止EcoliRecA蛋白和DNA聚合酶被氧化。本专利技术一实施方式中，所述扩增反应缓冲液还包括磷酸肌酸和肌酸激酶；所述磷酸肌酸和肌酸激酶用于催化ATP再生，这一过程可以不断重复，从而可以保证高效扩增。需要说明的是，本专利技术试剂盒中Tris缓冲液、聚乙二醇、二硫苏糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶还可以分开储存，在试剂盒使用时再加以混合。本专利技术一实施方式中，所述试剂盒还包括镁离子制剂，所述镁离子制剂用于激活DNA聚合酶，从而缩短反应时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：Ecoli RecA蛋白、λ phage Orf蛋白、Ecoli SSB蛋白及DNA聚合酶。

【技术特征摘要】
1.一种重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：EcoliRecA蛋白、λphageOrf蛋白、EcoliSSB蛋白及DNA聚合酶。2.根据权利要求1所述的重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增反应缓冲液，所述扩增反应缓冲液包括Tris缓冲液，所述扩增反应缓冲液还包括聚乙二醇、二硫苏糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括镁离子制剂。4.一种重组酶聚合酶扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A、配置反应体系，所述反应体系包括：模板核酸分子、引物组、EcoliRecA蛋白、λphageOrf蛋白、EcoliSSB蛋白、DNA聚合酶、dNTP、ATP及扩增反应缓冲液，所述扩增反应缓冲液包括Tris缓冲液；B、向所述反应体系中加入镁离子制剂；C、在20至65℃条件下进行扩增反应。5.根据权利要求4所述的重组酶聚合酶扩增方法，其特征在于，所述扩增反应缓冲液还包括聚乙二醇、二硫苏糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，龚敬文，
申请(专利权)人：广州康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44