一种从外周血中提取免疫细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种从外周血中提取免疫细胞的方法，包括以下步骤：(1)采集人外周血，加入抗凝剂，然后移入离心管中离心，吸取上层血浆备用，下层细胞加入生理盐水，混合，获得细胞悬液；(2)将细胞悬液置于分离液中，于600‑800g离心20‑30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；(3)将免疫细胞等体积加入冻存液中，分装于细胞冻存管中，然后将冻存管置于程序冻存盒中，先以1‑2℃/min降温至‑20～‑25℃，接着以3‑5℃/min降温至‑40～‑45℃，再以5‑6℃降温至‑78～‑82℃，最后转入液氮中冻存。本发明专利技术的方法能够有效提供免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，提高回输到患者的细胞的安全性。

A method of extracting immune cells from peripheral blood

The invention discloses a method for extracting immune cells from peripheral blood, which comprises the following steps: (1) acquisition of human peripheral blood, then adding anticoagulant, into the centrifuge tube centrifugation, the upper plasma from standby, the cells in saline, mixed cell suspension was obtained; (2) cell suspension a liquid separation liquid, 600 800g 20 30min centrifugal, absorb the immune cells obtained albuginea cells; (3) the immune cells added volume of frozen liquid, packed in cell freezing tube, then the tube is placed in the frozen frozen box program, first in 1 2 C /min 20 ~ cooling to 25 DEG C, followed by cooling to 5 DEG C /min 3 40 ~ 45 DEG C, and then to 5 6 degrees down to 78 to 82 DEG C, finally transferred to liquid nitrogen freezing. The method of the present invention can effectively provide immune cell separation rate and survival rate after cell cryopreservation and resuscitation, and improve the safety of the cells retransfused to the patient.

【技术实现步骤摘要】
一种从外周血中提取免疫细胞的方法
本专利技术属于免疫细胞的提取
，具体涉及一种从外周血中提取免疫细胞的方法。
技术介绍
从人的外周血中提取免疫细胞，不仅在治疗癌症方面有较好的前景，而且从健康养生的角度来看，也可以在患者本人健康时从其外周血中提取免疫细胞，并在以后患者本人出现免疫低下或者其他症状时，可以将存储的免疫细胞回输给患者本人，提高患者的免疫力。目前，主要是利用低温冻存技术保存外周血的单个细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞，但在分离、冻存过程中，会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。此外，现有技术中所用的分离液对细胞有一定的毒性，不利于临床应用，而细胞冻存复苏后的存活率还可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种从外周血中提取免疫细胞的方法，可有效解决现有技术中存在的免疫细胞的分利率低，细胞冻存复苏后的存活率低，回输到患者的细胞存在安全性的问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种从外周血中提取免疫细胞的方法，包括以下步骤：(1)采集人外周血，加入抗凝剂，然后移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞加入生理盐水，混合，获得细胞悬液；其中，外周血与生理盐水的体积比为1-5：2-4；(2)将细胞悬液置于分离液中，于600-800g离心20-30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；其中，分离液包括以下重量份的组分：海藻糖3-6份、右旋糖苷1-3份、千金藤碱1-3份、银耳多糖1-2份、海带多糖0.5-1.2份、超低粘度海藻酸钠0.2-0.5份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1-0.2份；(3)将免疫细胞等体积加入冻存液中，分装于细胞冻存管中，然后将冻存管放置于程序冻存盒中，先以1-2℃/min降温至-20～-25℃，然后再以3-5℃/min降温至-40～-45℃，再以5-6℃降温至-78～-82℃，最后转入液氮中冻存；其中，冻存液包括以下重量份的组分：海藻糖4-7份、右旋糖酐3-6份、二甲基亚砜2-5份、茶多酚0.3-0.8份、上层血浆13-18份、DMSO10-15份和生理盐水55-60份。进一步地，步骤(1)中外周血与生理盐水的体积比为2：3。进一步地，步骤(2)中分离液包括以下重量份的组分：海藻糖5份、右旋糖苷2份、千金藤碱2份、银耳多糖1.5份、海带多糖0.8份、超低粘度海藻酸钠0.3份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.2份。进一步地，步骤(2)中分离液通过以下方法制备得到：将各组分按重量份混合，然后溶解于灭菌后的注射用水中，配制成100重量份的溶液，再经过0.22μm滤膜过滤，制得。进一步地，步骤(2)中分离液的密度为1.050-1.070g/cm3，渗透压为280-290smol/kg，pH为7-8，粘度为2.0-3.0cp。进一步地，步骤(3)中冻存液包括以下重量份的组分：海藻糖5份、右旋糖酐4份、二甲基亚砜3份、茶多酚0.5份、上层血浆16份、DMSO12份和生理盐水59.5份。进一步地，步骤(3)中冻存冻存程序为先以2℃/min降温至-20～-25℃，然后再以5℃/min降温至-40～-45℃，再以6℃降温至-78～-82℃，最后转入液氮中冻存。进一步地，右旋糖酐为Dextran70。本专利技术提供的一种从外周血中提取免疫细胞的方法，具有以下有益效果：本专利技术将外周血细胞离心，上层血浆作为冻存液的一部分，可有效减少回输过程中的免疫排斥作用。本专利技术分离液采用特定组分组合，其海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类，由两个葡萄糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，其银耳多糖和海带多糖，对目的细胞也能起到保护作用，同时还可以为目的细胞提供营养，再者与千金藤碱还可以起到抑菌作用，与其他物质一起对目的细胞的分离起到协同作用使细胞很好的分离出来；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质，有助于红细胞的沉淀；采用本分离液对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力作用下分布在离心管底和分离介质层。采用本专利技术提供的冻存液，在特定的冻存程序下可对目的细胞进行有效冻存，且可有效降低其损失量，保存其存活率和较高的活性。具体实施方式实施例1一种从外周血中提取免疫细胞的方法，包括以下步骤：(1)采集人外周血，加入抗凝剂，然后移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞加入生理盐水，混合，获得细胞悬液；其中，外周血与生理盐水的体积比为1：2；(2)将细胞悬液置于分离液中，于800g离心30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；其中，分离液包括以下重量份的组分：海藻糖3份、右旋糖苷(Dextran70)1份、千金藤碱1份、银耳多糖1份、海带多糖0.5份、超低粘度海藻酸钠0.2份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1份；分离液通过以下方法制备得到：将各组分按重量份混合，然后溶解于灭菌后的注射用水中，配制成100重量份的溶液，再经过0.22μm滤膜过滤，制得；分离液的密度为1.050-1.070g/cm3，渗透压为280-290smol/kg，pH为7-8，粘度为2.0-3.0cp。(3)将免疫细胞等体积加入冻存液中，分装于细胞冻存管中，然后将冻存管放置于程序冻存盒中，先以2℃/min降温至-20～-25℃，然后再以5℃/min降温至-40～-45℃，再以6℃降温至-78～-82℃，最后转入液氮中冻存。其中，冻存液包括以下重量份的组分：海藻糖4份、右旋糖酐(Dextran70)3份、二甲基亚砜2份、茶多酚0.3份、上层血浆13份、DMSO10份和生理盐水55份。实施例2一种从外周血中提取免疫细胞的方法，包括以下步骤：(1)采集人外周血，加入抗凝剂，然后移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞加入生理盐水，混合，获得细胞悬液；其中，外周血与生理盐水的体积比为1：4；(2)将细胞悬液置于分离液中，于800g离心30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；其中，分离液包括以下重量份的组分：海藻糖6份、右旋糖苷(Dextran70)3份、千金藤碱3份、银耳多糖2份、海带多糖1.2份、超低粘度海藻酸钠0.5份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.2份；分离液通过以下方法制备得到：将各组分按重量份混合，然后溶解于灭菌后的注射用水中，配制成100重量份的溶液，再经过0.22μm滤膜过滤，制得；分离液的密度为1.050-1.070g/cm3，渗透压为280-290smol/kg，pH为7-8，粘度为2.0-3.0cp。(3)将免疫细胞等体积加入冻存液中，分装于细胞冻存管中，然后将冻存管放置于程序冻存盒中，先以2℃/min降温至-20～-25℃，然后再以5℃/min降温至-40～-45℃，再以6℃降温至-78～-82℃，最后转入液氮中冻存。其中，冻存液包括以下重量份的组分：海藻糖7份、右旋糖酐(Dextran70)6份、二甲基亚砜5份、茶多酚0.8份、上层血浆18份、DMSO15份和生理盐水60份。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从外周血中提取免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集人外周血，加入抗凝剂，然后移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞加入生理盐水，混合，获得细胞悬液；其中，外周血与生理盐水的体积比为1‑5：2‑4；(2)将细胞悬液置于分离液中，于600‑800g离心20‑30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；其中，分离液包括以下重量份的组分：海藻糖3‑6份、右旋糖苷1‑3份、千金藤碱1‑3份、银耳多糖1‑2份、海带多糖0.5‑1.2份、超低粘度海藻酸钠0.2‑0.5份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1‑0.2份；(3)将免疫细胞等体积加入冻存液中，分装于细胞冻存管中，然后将冻存管放置于程序冻存盒中，先以1‑2℃/min降温至‑20～‑25℃，接着以3‑5℃/min降温至‑40～‑45℃，再以5‑6℃降温至‑78～‑82℃，最后转入液氮中冻存；其中，冻存液包括以下重量份的组分：海藻糖4‑7份、右旋糖酐3‑6份、二甲基亚砜2‑5份、茶多酚0.3‑0.8份、上层血浆13‑18份、DMSO 10‑15份和生理盐水55‑60份。

【技术特征摘要】
1.一种从外周血中提取免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集人外周血，加入抗凝剂，然后移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞加入生理盐水，混合，获得细胞悬液；其中，外周血与生理盐水的体积比为1-5：2-4；(2)将细胞悬液置于分离液中，于600-800g离心20-30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；其中，分离液包括以下重量份的组分：海藻糖3-6份、右旋糖苷1-3份、千金藤碱1-3份、银耳多糖1-2份、海带多糖0.5-1.2份、超低粘度海藻酸钠0.2-0.5份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1-0.2份；(3)将免疫细胞等体积加入冻存液中，分装于细胞冻存管中，然后将冻存管放置于程序冻存盒中，先以1-2℃/min降温至-20～-25℃，接着以3-5℃/min降温至-40～-45℃，再以5-6℃降温至-78～-82℃，最后转入液氮中冻存；其中，冻存液包括以下重量份的组分：海藻糖4-7份、右旋糖酐3-6份、二甲基亚砜2-5份、茶多酚0.3-0.8份、上层血浆13-18份、DMSO10-15份和生理盐水55-60份。2.根据权利要求1所述的从外周血中提取免疫细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中外周血与生理盐水的体积比为2：3。3.根据权利要求1所述的从外周血中提取免疫细胞的方法，其特征在于，步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小东，王健，赵翔，熊华强，宋彩霞，王仁杰，邱阳，黄启程，李国焱，唐玲，叶劲涛，曹玉昊，
申请(专利权)人：重庆斯德姆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50