一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法技术

一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方。方法：用胶原酶IV，DNA酶I和RPMI1640混合消化液消化胰腺组织后，通过100μm的尼龙滤网过滤，经过密度梯度离心，收集离心后中间层细胞，分析细胞获得率、存活率和细胞种类。结果：每只小鼠可获取(3.0±1.2)x10

A method of immuno cell isolation in the pancreas of mice

An immune cell separator that is infiltrated in the pancreas of mice. Methods: collagenase IV, DNA enzyme I and RPMI1640 mixed digestive juice were used to digest the pancreatic tissue. After filtration through a 100 nylon M filter screen, centrifugation and middle layer cells were collected after density gradient centrifugation, and the cell survival rate, survival rate and cell types were analyzed. Results: each mouse could obtain (3 + 1.2) x10

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法
本申请涉及一种组织内细胞分离方法，特别是一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法。
技术介绍
胰腺作为人体中最重要的器官之一，其生理作用和病理变化都与生命息息相关。近年来，随着人们生活质量的提高，人们的饮食结构也发生着变化，从而也出现了越来越多的胰腺疾病。目前在我国乃至世界范围内胰腺疾病的发病率均有上升的趋势。有关胰腺的疾病，诸如急慢性胰腺炎、特发性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺癌等的报道越来越多，胰腺疾病逐渐被引起重视。很多研究学者对胰腺的研究多集中在对胰腺癌相关信号转导通路研究、对胰腺癌发病分子机制研究、对胰腺癌的分子遗传学研究等。因此分离胰腺内浸润的免疫细胞成为多种研究的重要基础工作。但目前没有系统的胰腺内浸润免疫细胞的分离方法，已有其他组织器官内细胞的分离方法则耗时长、得率低、步骤复杂，并且无法用于胰腺内细胞的分离。
技术实现思路
针对现有分离方法耗时长、得率低、步骤复杂且无法用于胰腺内浸润免疫细胞的缺陷，本专利技术提供一套简化、高效、稳定的小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法。具体的，本专利技术的小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法，包括如下步骤：(1)胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm直径放置于冰上的培养皿，用磷酸盐缓冲溶液清洗1-2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至1mm2的均匀体积块；(2)胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/mlDNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出，吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；(3)密度梯度离心：将4ml80％的percoll溶液加入到15ml的离心管中，离心管倾斜60度，然后将用8ml40％的percoll溶液重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，所述4ml80％及8ml40％的percoll溶液由RPMI-1640完全培养基稀释，两层液体间可见清晰的分界面；在25度、400g、25min、升速为1、降速为0的条件下离心；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸分界面中间细胞层液体至新的15ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液至15ml，上下颠倒混匀；离心，常温、1500rpm/5min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液重悬沉淀，即得所需细胞。采用酶消化提取小鼠胰腺淋巴细胞，提取步骤简化、高效、稳定，获取细胞的数量多、活率高、纯度高，为研究胰腺相关炎症或肿瘤疾病的分子免疫学机制提供可靠方法，为胰腺疾病发病机制的阐明奠定坚实的基础。附图说明图1为台盼蓝染色法检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的活细胞数量图2为AnnexinV/PI凋亡试剂检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的细胞活率图3为CD45、CD3、CD4、CD8、CD19抗体标记检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的细胞类型的比例具体实施方式1材料和方法1.1实验动物:C57BL/6雄性鼠,6～8周龄，购于上海斯莱克动物中心，饲养在SPF级动物房内。1.2主要试剂及器材：试剂：RPMI1640培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(ICP，NewZealand)，1XPBS(磷酸盐缓冲液,0.01mol/L),anti-mouseCD45单克隆抗体，anti-CD3单克隆抗体,anti-mouseCD4单克隆抗体,anti-mouseCD8单克隆抗体,anti-mouseCD19单克隆抗体(美国BD)；胶原酶IV消化液(50mg/ml)；DNA酶I(1mg/ml)；Percoll分离液等。器材：15ml、50ml离心管；细胞培养皿；手术器械；Eppendorf离心机,Niko显微镜，BDFACSCantoTMII流式细胞仪等1.3小鼠胰腺淋巴细胞分离方法1.3.1胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm(直径)培养皿中(放置于冰上)，用磷酸盐缓冲溶液清洗1-2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至适度大小(1mm2)的均匀体积块；1.3.2胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/mlDNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出；吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；1.3.3密度梯度离心：将4ml80％的percoll溶液(1640完全培养基稀释)加入到15ml的离心管中，离心管倾斜至水平(离心管倾斜约60度)，然后将用8ml40％的percoll溶液(1640完全培养基稀释)重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，两层液体间可见清晰的分界面；离心(室温，25度，400g,25min,升速为1，降速为0)；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸中间层细胞层液体至新的15ml离心管中，加入PBS至15ml,上下颠倒混匀；离心(常温，1500rpm/5min)，弃去上清液，用PBS重悬沉淀，待用。1.4小鼠胰腺淋巴细胞计数：将分离重悬的细胞在倒置相差显微镜下观察分离得到的胰腺组织淋巴细胞分离情况，人工进行细胞计数。1.5小鼠胰腺淋巴细胞活力检测：采用台盼兰染色法鉴定细胞活力。将0.4％台盼蓝溶液90μl加入至10μl细胞悬液中，充分混匀，于20℃下孵育3min，在3min内，用计数板分别计数活细胞和死细胞，不着色的为活细胞。1.6小鼠胰腺淋巴细胞活率检测：采用AnnexinV/PI凋亡试剂检测。用预冷的PBS洗涤细胞2次，1500rpm，4℃离心5min。收集1-3×105细胞。加入100μl1×BindingBuffer重悬细胞。加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPlStainingSolution，轻轻混匀。避光、室温反应10min。加入400μl1×BindingBuffer，混匀，用流式细胞仪检测。1.7小鼠胰腺淋巴细胞CD45、CD3、CD4、CD8、CD19阳性细胞含量检测：细胞计数，后取100μl(1x106细胞)细胞重悬液于干净的EP管中，离心沉淀细胞，1xPBS重悬细胞后，加入FITC标记的抗小鼠CD45、CD3、CD4、CD8、CD19抗体各0.5ul，轻轻混匀，4℃避光孵育20min。后加1ml1xPBS，4℃离心，1500rpm，5min，弃上清，最后加入200ul1xPBS重悬后经流式细胞仪检测。收集10000个细胞用于数据分析，采用FITC标记的同型抗体作为阴性对照。1.8统计学方法：数据采用GraphpadPrism5统计软件进行处理分析,以x±s表示。单样本用t检验方法计算细胞产量和存活率。2结果2.1小鼠胰腺淋巴细胞观察2.2小鼠胰腺淋巴细胞数量、活力及特性：采用上述分离方法，共分离2只小鼠的胰腺，每只小鼠可获取1-3x105个淋巴细胞。台盼兰染色后细胞活力较高，死细胞少，见图1，不着色的为活细胞2.3小鼠胰腺淋巴细胞的细胞活率：通过流式细胞仪检测，采用上述方法获取小鼠的胰腺淋巴细胞活率为96.7％，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法，包括如下步骤：(1)胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm直径放置于冰上的培养皿，用磷酸盐缓冲溶液清洗1‑2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至1mm2的均匀体积块；(2)胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/ml DNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出，吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；(3)密度梯度离心：将4ml 80％的percoll溶液加入到15ml的离心管中，离心管倾斜60度，然后将用8ml 40％的percoll溶液重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，所述8ml 40％的percoll溶液由RPMI‑1640完全培养基稀释，两层液体间可见清晰的分界面；在25度、400g、25min、升速为1、降速为0的条件下离心；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸分界面中间细胞层液体至新的15ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液至15ml，上下颠倒混匀；离心，常温、1500rpm/5min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液重悬沉淀，即得所需细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法，包括如下步骤：(1)胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm直径放置于冰上的培养皿，用磷酸盐缓冲溶液清洗1-2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至1mm2的均匀体积块；(2)胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/mlDNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出，吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；(3)密度梯度离心：将4ml80％的percoll...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，徐薇，颜克鹏，卫林，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32