一种大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法技术

本发明专利技术提供一种大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)胸导管取材；(b)通过酶消化法，得到大鼠淋巴内皮细胞；(c)免疫磁珠法，纯化大鼠淋巴内皮细胞；(d)将纯化的大鼠淋巴内皮细胞铺置包被的细胞培养皿，并使用完全培养基培养大鼠淋巴内皮细胞。本发明专利技术提供的大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法可获得产量高、纯度高且生存时间较长的大鼠淋巴内皮细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法。
技术介绍
近年来肿瘤转移方面的研究大都集中在肿瘤细胞和淋巴管作用的分子机制方面，特别是淋巴道转移的肿瘤研究，其离不开淋巴管内皮细胞。目前国内外在此方面的研究大都是采用大动物的淋巴管进行内皮细胞培养，但不能与常用来构建动物模型的大鼠相一致，为此，如何能通过较为简单的方法获得大量有活性并且纯度很高的大鼠淋巴内细胞，一直是进行基础研究和临床研究亟待解决的重要问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种可获得产量高、纯度高且生存时间较长的大鼠淋巴内皮细胞分。为了解决解决上述所涉及到的问题，本专利技术采取如下方法获得大鼠淋巴内皮细胞：(a)胸导管取材；(b)通过酶消化法，得到大鼠淋巴内皮细胞；(c)免疫磁珠法，纯化大鼠淋巴内皮细胞；(d)将纯化的大鼠淋巴内皮细胞铺置包被的细胞培养皿，并使用完全培养基培养大鼠淋巴内皮细胞；所述的大鼠为220-250g，4周龄的SD大鼠；所述胸导管取材是将大鼠术前14-18h禁食，术前2h饲喂脂肪，麻醉处死，消毒，在无菌条件下暴露胸腹腔，找到呈现乳白色的胸导管，结扎后，完整取下；所述酶消化法，得到大鼠淋巴内皮细胞是通过将分离下来的胸导管尽量除去外膜和周围结缔组织，用PBS缓冲液腔内冲洗胸导管后，用0.01％-0.05％的胰酶和0.05-0.1％的胶原酶I灌注，37℃消化10-20min，收集含有内皮细胞的腔内液体，并加入含10％胎牛血清的EGM2培养基终止消化，1500r离心5min，收集细胞，加入EGM2培养基；所述免疫磁珠法，纯化大鼠淋巴内皮细胞是将山羊抗兔的免疫磁珠在EGM2基础培养基中清洗3次，然后在单克隆PECAM-1抗体中4℃过夜孵育，然后在EGM2完全培养基中清洗3次，然后加入到消化后收集的细胞液中，4℃旋转轻摇孵育30-60min，然后用EGM2完全培养基清洗磁珠2-3次，最后将其放入VI胶原酶包被的细胞皿中，加入EGM2完全培养基，置于37℃、5％(v/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中培养增殖；所述包被的细胞培养皿为0.4-0.6g/L的VI胶原酶包被的；所述的完全培养基为含5％-10％的大鼠血清，10-20％FBS，10-100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物，1ng/mLbFGF以及EGM2基础培养基；本专利技术通过简单的酶消化获得大鼠淋巴内皮细胞，该方法操作简单，而且可以获得大量并且具有良好活性的角膜内皮细胞；本专利技术解决了细胞损伤大、获得率低、纯度不高等问题，分离的大鼠淋巴内皮细胞，产率高，活性好，纯度高，该实验具有稳定的可重复性。附图说明图1：大鼠淋巴内皮细胞(×100)图2：鉴定大鼠淋巴内皮细胞免疫荧光电镜(×100)具体实施方式为了使本专利技术的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述，此处所阐述的具体实施方式仅针对本专利技术进行解释，并不用于限定本专利技术。本专利技术选择4周龄的SD大鼠，分离大鼠淋巴内皮细胞。具体操作如下：1.取10只体重为220-250g，4周龄的SD大鼠，术前14-18h禁食，术前2h饲喂脂肪，戊巴比妥钠麻醉处死，迅速浸泡于75％乙醇中消毒，在超净工作台中行T型剪开胸腹部，完全暴露胸腹腔，在主动脉的后外侧，找到呈现乳白色的胸导管，结扎后游离胸导管，完整取下；2.将分离下来的胸导管放置于无菌的PBS缓冲液中，尽量除去外膜和周围结缔组织，用PBS缓冲液腔内冲洗胸导管；3.用0.01％-0.05％的胰酶和0.05-0.1％的胶原酶I灌注胸导管，37℃消化10-20min，收集含有内皮细胞的腔内液体，并加入含10％胎牛血清的EGM2培养基终止消化，1500r离心5min，去除上清，加入EGM2培养基重悬细胞；4.将山羊抗兔的免疫磁珠在EGM2基础培养基中清洗3次，然后在单克隆PECAM-1抗体中4℃过夜孵育，然后在EGM2完全培养基中清洗3次，然后加入到步骤3中重悬的细胞液中，4℃旋转轻摇孵育30-60min，然后用EGM2完全培养基清洗磁珠2-3次，最后将其放入0.6g/L的VI胶原酶包被的细胞皿中，加入EGM2完全培养基(5％的大鼠血清，10-20％FBS，10-100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物，1ng/mLbFGF)，置于37℃、5％(v/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中培养增殖。5.免疫荧光电镜检测：(1)待细胞生长6d后，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4％多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；(2)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％TritonX-100透膜15min；(3)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4％BSA封闭细胞30min；(4)按1∶100的比例稀释单克隆vWF一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育过夜；(5)PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀释二抗，37℃条件下放置1h；(6)用PBS冲洗3次，每次10min，最后DAPI染细胞核并用荧光显微镜拍照。以上已经对本专利技术创造的较佳实施例进行详细阐述，但本专利技术创造不限定于上述实施例，凡在本专利技术的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术提供一种大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)胸导管取材；(b)通过酶消化法，得到大鼠淋巴内皮细胞；(c)免疫磁珠法，纯化大鼠淋巴内皮细胞；(d)将纯化的大鼠淋巴内皮细胞铺置包被的细胞培养皿，并使用完全培养基培养大鼠淋巴内皮细胞。本专利技术提供的大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法可获得产量高、纯度高且生存时间较长的大鼠淋巴内皮细胞。

【技术特征摘要】
1.本发明提供一种大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)胸导管取材；(b)通过酶消化法，得到大鼠淋巴内皮细胞；(c)免疫磁珠法，纯化大鼠淋巴内皮细胞；(d)将纯化的大鼠淋巴内皮细胞铺置包被的细胞培养皿，并使用完全培养基培养大鼠淋巴内皮细胞。本发明提供的大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法可获得产量高、纯度高且生存时间较长的大鼠淋巴内皮细胞。2.根据权利要求1所述的大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的大鼠为220-250g，4周龄的SD大鼠。3.根据权利要求1所述的大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(a)中胸导管取材是将大鼠术前14-18h禁食，术前2h饲喂脂肪，麻醉处死，消毒，在无菌条件下暴露胸腹腔，找到呈现乳白色的胸导管，结扎后，完整取下。4.根据权利要求1所述的大鼠淋巴内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(b)通过酶消化法，得到大鼠淋巴内皮细胞是通过将分离下来的胸导管尽量除去外膜和周围结缔组织，用PBS缓冲液腔内冲洗胸导管后，用0.01％-0.05％的胰酶和0.05-0.1％的胶原酶I灌注，37℃消化10-20min，收集含有内皮细胞的腔...

【专利技术属性】
技术研发人员：田瑞，张亚洲，蒋敏，齐来俊，
申请(专利权)人：江苏齐氏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32