检测HIV‑1耐药突变位点的成套引物及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因检测领域，提供了一种检测HIV‑1耐药突变位点的成套引物，包括序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了上述检测HIV‑1耐药突变位点的成套引物的应用。本发明专利技术可以只需一轮PCR反应即可扩增出大于1000拷贝每毫升的HIV‑1 pol区基因序列，减少了工作强度，降低了污染的机率，同时扩增出的片段覆盖的耐药突变位点的范围广泛，适用于我国主要HIV‑1流行亚型的耐药突变位点检测。

1 sets of primers to detect HIV drug-resistance mutations and its application

The invention belongs to the field of genetic testing, provides a detection of HIV 1 mutation resistant primer set, including nucleotide sequence of SEQ ID No.1 to SEQ ID No.5 shown. The application of the invention also provides a complete set of primers for the detection of HIV 1 mutation sites in the resistance. The invention can only one round of PCR can be amplified more than 1000 copies per ml of HIV 1 pol sequence, reduced working intensity, reduce the pollution probability, range resistance cover and the amplified fragment of the mutation site wide applicable to China's 1 major HIV prevalence of drug-resistant subtype the detection of mutation sites.

【技术实现步骤摘要】
检测HIV-1耐药突变位点的成套引物及其应用
本专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物及其应用。
技术介绍
艾滋病(AIDS)最早在美国同性恋人群中发现，1981年加州大学洛杉矶分校的MichelaelD.Gottlieb医生发现了这种奇怪的免疫缺陷现象。在之后1983年，法国巴斯德研究院最终确认了这种疾病的元凶是人类免疫缺陷病毒(HIV)。在之后的30多年里，艾滋病在全球迅速蔓延，据世界卫生组织的数据：艾滋病毒迄今已造成3500多万例死亡。到2015年底，约有3670万(3400-3980万)名艾滋病毒携带者。2015年，全球有约210万(180-240万)人新感染艾滋病毒。中国自1985年发现第一例HIV感染病例以来，感染人数每年增长，流行发展的趋势严峻。根据中国疾病预防控制中心的数据，截至2016年9月，我国报告现存活艾滋病病毒感染者和病人65.4万例，累计死亡20.1万例。人类免疫缺陷病毒(HIV)具有高度的基因变异性，根据其基因序列的差异，将其分为HIV-1型和HIV-2型。目前世界范围内流行的主要为HIV-1型。HIV-1又进一步分为3个组：M组、O组和N组。M组内又可分为A-D，F-H和J、K共9个基因亚型，另外还有88个以上流行重组型(CRF)。2006－2007年第三次全国HIV-1分子流行病学调查结果显示，我国存在至少12种HIV-1基因型，已经成为全球HIV-1基因亚型最多的国家。我国HIV-1流行的亚型主要有CRF07_BC(35.5％)、CRF01_AE(27.6％)、CRF08_BC(20.1％)和B’(9.6％)，占HIV感染者总数的92.8％。自从1987年第一个抗艾滋病药物齐多夫定(AZT)上市以来，抗艾滋病药物的研究突飞猛进，目前美国FDA网站上公布的抗艾滋病药物主要有6大类、35个品种。抗艾滋病药物主要包括核苷类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、CCR5拮抗剂、整合酶抑制剂。我国自2003年以来实行“四免一关怀”政策，对艾滋病患者开展广泛的抗病毒治疗，截止2016年底，进行抗病毒治疗的人数已经达到48.9万。然而由于HIV病毒容易产生变异，并最终造成蛋白位点发生变化，使艾滋病药物失去靶点，在病人体内产生耐药，造成治疗失败。为了提高治疗的效果，防止耐药株的传播，因此有必要对治疗人群及新发感染者进行耐药的检测。这对于减缓耐药病毒株的产生及传播，以及指导患者个体化临床用药有着重要的意义。目前HIV-1耐药的检测有两种类型，一种是表型检测，另外一种是基因型检测。表型检测是利用细胞培养的方法进行病毒培养，然后通过不同药物与病毒共培养，观察计算抑制的效率，得出病毒是否耐药的结果。但是此方法成本高昂，对实验室和人员的要求较高，难以对多个耐药突变进行评估，耗时长，劳动量大，对混合型检测灵敏度低，所以目前只限于基础研究使用。基因型检测是采用PCR扩增测序的方法，对耐药突变位点进行分析，最终得出耐药报告。基因型检测依赖于表型检测的数据，对HIV的基因序列进行分析。它同时检测多种耐药突变，也可以检测出潜在突变点，可以预测多个耐药突变造成的影响，检测的速度快，成本低。是目前在实验室使用最为广泛的检测方法。HIV-1耐药位点的研究主要集中在HIV-1pol基因，这里聚集着蛋白酶基因，逆转录酶基因以及整合酶基因。这段区域也是核苷类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂四大类HIV-1药物的靶向区域。根据我国《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》(第四版)的建议，对于接受抗病毒治疗的患者，在正常服药的情况下，在病毒载量>1000拷贝每毫升(copy/mL)的情况下，需要进行耐药检测。目前国内的基因型耐药检测方法主要分三种，一是雅培ViroSeqTMHIV-1基因分型系统、达安基因人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)耐药基因型检测试剂盒(PCR-测序法)、国内外大学建立的in-house方法。这三种耐药检测的方法流程大致相同，主要过程是提取HIV-1核酸，通过一轮或者两轮PCR对HIV-1病毒基因组中蛋白酶和部分逆转录酶的基因片段进行RT-PCR，然后再使用Sanger法对PCR产物进行测序分析。前两者出现的商业化检测试剂盒，已经取得中国食品药品监督管理局批准上市。这些建立的in-house方法因为价格便宜也应用广泛，取得了很多的临床研究工作。然而，目前上市的这两种检测系统主要是为欧美的B亚型株来设计，对中国的主要流行病毒株CRF01_AE亚型、CRF07_BC重组型，B’亚型，CRF08_BC重组型等效果并不理想。而且这些试剂盒价格昂贵，不利于在我国大规模使用。而国内外研究机构建立的in-house方法操作繁琐，操作过程、质量控制和分析方法不统一，难以大规模临床使用；且大多采用两轮PCR进行扩增，容易造成PCR产物的污染。例如，雅培ViroSeqTMHIV-1基因分型系统不仅操作繁琐，且检测范围是2,000-750,000拷贝每毫升，而达安和实验室自建的in-house方法都是通过两轮PCR的方法来得到测序的模板，操作复杂且容易污染。就扩增区域而言，达安基因的MAW26/RT21扩增片段的范围为HIV-1基因组的2147-3462区间，覆盖的位点包括蛋白酶基因和逆转录基因1-304氨基酸编码子位置；美国CDC的扩增片段的范围为HIV-1基因组的2243-3326区间，覆盖的位点包括蛋白酶基因和逆转录基因1-259氨基酸编码子位置；雅培的ViroSeqTMHIV-1基因分型系统的扩增片段的范围为HIV基因组的1832-3577区间，也只是覆盖了蛋白酶基因的全长和逆转录酶的1-335位氨基酸编码子区域。上述方法均只能扩增HIV-1基因组的pol基因的部分耐药突变位点，不能覆盖所有的耐药突变位点。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物及其应用。本专利技术的第一个方面提供了一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，所述成套引物含有序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.5所示的核苷酸序列：SEQIDNo.1：GAAATGATGACAGCATGTCAGGGAG；(以下称引物1)；SEQIDNo.2：GAAATGATGACAGCATGCCAGGGAG；(以下称引物2)；SEQIDNo.3：CAAACTCCCACTCAGGAATCCAGGT；(以下称引物3)；SEQIDNo.4：CAAACTCCCATTCAGGAATCCAGGT；(以下称引物4)；SEQIDNo.5：CAAATTCCCACTCAGGAATCCAGGT；(以下称引物5)。根据本专利技术第一方面的成套引物，所述成套引物用于扩增HIV-1基因组的Pol基因蛋白酶和逆转录酶基因片段，所述基因片段包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸的编码子和逆转录酶基因区1-410位氨基酸的编码子。根据本专利技术第一方面的成套引物，所述耐药突变位点为位于HIV-1基因组的Pol基因的核苷类逆转录酶抑制剂(nucleosideRTinhibitorresistancemutations,NRTI)相关位点、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测HIV‑1耐药突变位点的成套引物，所述成套引物含有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示的核苷酸序列：SEQ ID No.1：GAAATGATGACAGCATGTCAGGGAG；SEQ ID No.2：GAAATGATGACAGCATGCCAGGGAG；SEQ ID No.3：CAAACTCCCACTCAGGAATCCAGGT；SEQ ID No.4：CAAACTCCCATTCAGGAATCCAGGT；SEQ ID No.5：CAAATTCCCACTCAGGAATCCAGGT。

【技术特征摘要】
1.一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，所述成套引物含有序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.5所示的核苷酸序列：SEQIDNo.1：GAAATGATGACAGCATGTCAGGGAG；SEQIDNo.2：GAAATGATGACAGCATGCCAGGGAG；SEQIDNo.3：CAAACTCCCACTCAGGAATCCAGGT；SEQIDNo.4：CAAACTCCCATTCAGGAATCCAGGT；SEQIDNo.5：CAAATTCCCACTCAGGAATCCAGGT。2.根据权利要求1所述的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，其特征在于：所述成套引物用于扩增HIV-1基因组的Pol基因蛋白酶和逆转录酶基因片段，所述基因片段包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸的编码子和逆转录酶基因区1-410位氨基酸的编码子。3.根据权利要求1所述的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，其特征在于：所述耐药突变位点为位于HIV-1基因组的Pol基因的核苷类逆转录酶抑制剂相关位点、非核苷类逆转录酶抑制剂相关位点和蛋白酶抑制剂相关位点。4.一种检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物。5.根据权利要求4所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：所述成套引物的量为：SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的引物和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的引物、SEQIDNo.4所示的核苷酸序列的引物和SEQIDNo.5所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数为的比例为1:(1-2)，优选为1:(1.2-1.8)，进一步优选为1:1.5。6.根据权利要求4或5所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：所述SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：郜培杰，张福杰，史亚伦，王旭东，马鹏飞，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京地坛医院，
类型：发明
国别省市：北京,11