本发明专利技术公开了一种动物细胞无血清低密度培养基及其应用，该动物细胞无血清低密度培养基以合成培养基为原材料，添加胰岛素粉末、转铁蛋白粉末、Ｌ－谷氨酰胺粉末、亚硒酸钠粉末、乙醇胺溶液、脂类溶液、表皮生长因子粉末、重组人酸性成纤维生长因子、维生素溶液、植物水解物溶液、腐胺、硫酸亚铁、氢化可的松、胰岛素类因子，此培养基能够满足哺乳动物细胞在无血清和低密度条件下的生长代谢和产物表达。通过使用动该物细胞无血清低密度培养基，结合Ｄ－多聚赖氨酸粉末包被９６孔培养板可完成无血清克隆化，实现动物细胞无血清培养的连续性，提高产物表达的稳定性，确保产品质量及安全性，增强生产工艺的可控性。具有广泛的使用范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域的细胞工程技术，主要涉及动物细胞无血清低密度(50-5X 103cellS/mL)培养基及其应用。该动物细胞无血清低密度培 养基不仅能够进行多种动物细胞的无血清克隆化筛选而且能够满足密度 50-5xl03cells/mL时细胞的生长代谢和产物表达。
技术介绍
动物细胞培养是生命科学基础理论研究和生物
广泛应用的关 键技术之一。动物细胞由于具有活性高、稳定性好等优点已被生物制药行业 中被广泛使用。目前美国FDA批准上市的生物技术药物中70%由动物细胞 表达生产的。其广泛使用的动物细胞有CH0、 SP2/0、 HEK293、 Vero和B服等。生物制药行业中，优化和筛选稳定表达目标产物的动物细胞系是关键技 术之一。通常采用融合技术或转染技术获得表达目标产物的动物细胞系，采 用传统克隆化方法筛选获得生长代谢正常、产物表达稳定的细胞株。传统克 隆化方法通常采用动物血清、饲养细胞等动物来源成分进行。动物细胞体 外培养过程中，影响动物细胞体外培养效果的最直接、最重要的环境因素是 培养基。大多数动物细胞采用含血清培养基进行体外培养。血清等动物来源 成分不明确、批次不稳定、价格昂贵等较多因素会影响实验重复性、可靠性 以及生产稳定性。无血清培养基以其成分明确、批次差异小、有利于产物的分离纯化及无 源性污染等优点越来越受到使用者的欢迎。无血清培养基一般是在合成培 养基的基础上添加血清替代成分而构成。目前已有商品化的无血清培养基，如SFM-II (Gibco公司)、SFM4(Hyclone公司)、EX-302 (JRH公司)、EX-620 (JRH公司)、EX-610 (JRH公司)、EX-CELL 525 (JRH公司)等。目前报道 的无血清培养基仅能够满足细胞密度大于5X103cellS/mL时，细胞的生长 代谢和产物表达，且使用细胞株范围较窄。如KimEJ，等人在以合成培养基 D/F12为基础添加氨基酸、乙醇胺、卵磷脂等物质研究开发出了细胞密度大 于6.4X103cells/mL时适合重组CH0细胞生长代谢的无血清培养基w;同年， Kim EJ等人以合成培养基IMDM为基础开发了一种适合rCHO (表达EPO)且 细胞密度大于5X10Vells/mL时的无血清培养基，此无血清培养基中添加 了蛋氨酸、谷氨酸、PF_68、胰岛素、硫酸锌、暖磷脂、丝氨酸、氢化可的 松等物质。 Do Yun Kim等人在2006年以IMDM为基础添加酵母提取物、硫 酸锌、氯化铜、亚硒酸钠、乙醇胺等物质开发了适合rCHO细胞的无血清培 养基，能够实现细胞在高密(7X106cell/mL)的的生长。此类满足细胞密 度大于5X103cellS/mL时细胞生长代谢的无血清培养基的文献较多。目前生物制药行业，动物细胞培养多采用传统克隆化方法(含血清和饲 养细胞)获得的细胞株，此细胞株经无血清悬浮驯化后方可用于生产。无血 清悬浮驯化过程会出现外源基因丢失和目标产物表达水平下降的现象;.同 时，生产用动物细胞在体外长期培养过程中同样存在目标产物分泌表达稳定 性的问题〔"，如外源基因丢失导致目标产物表达水平下降等现象。解决无血 清条件下动物细胞克隆化方法，对筛选获得稳定表达产物的细胞株尤为重 要。目前，在无血清条件下能满足多种动物细胞低密度培养的培养基尚未见 报道。经申请人所作的资料检索，相关的参考文献如下 1 、 Glassy M C， Tharakan J P， Chao P C. Serum free media in hybridom a culture and monoclonal antibody production . Biochemical and Biotechnology,1988,32:1015-1028;2、 Even MS, Sandusky CB， Barnard ND.Serum-free hybridoma culture: ethical, scientific and safety considerations.Trends Biotechnol. 2006,24(3) :105-8;3、 Froud SJ. The development, benefits and disadvantages of serum-free media.Dev Biol Stand. 1999;99:157-66;4、 Gstraunthaler G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 2003;20 (4) :275-81;5、 Kim EJ, Kim NS. Lee GM.Development of a serum-free medium for dihydrofolate reductase-deficient Chinese hamster ovary cells ( DG44 ) using a statistical design: beneficial effect of weaning of cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999Apr;35 (4) :178-82;6、 Kim EJ, Kim NS, Yoon SK， Ahn YH, Song JY.Development of a serum-free medium for the production of erythropoietin by suspension culture of recombinant Chinese hamster ovary cells using a statistical design. J Biotechnol. 1999 Apr 15;69 (2-3) :85-93;7、 Do Yun Kim， Joon Chul Lee , Ho Nam Chang, Duk Jae Oh.Development of serum-free media for a recombinant CHO cell line producing recombinant antibody, Enzyme and Microbial Technology 39 (2006) 42"33;8 、 Barnes LM， Dickson AJ.Mammalian cell factories for efficient and stable protein expression. Curr Opin Biotechnol. 2006; 17 (4): 381-6。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种动物细胞无血清低密度(5-5xl03cdls/mL) 培养基及其应用，该动物细胞无血清培养基适于哺乳动物细胞密度在 5-5xl03Cdls/mL时的生长代谢，并且维持细胞正常的比生长速率与产物合成速率，实现了细胞在无血清低密度条件下的生长代谢、产物表达，对传统克 隆化方法的作了有益的改进，使无血清条件下进行细胞克隆化筛选成为可 能。采用本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种动物细胞无血清低密度培养基，其特征在于制得的该动物细胞无血清低密度培养基是在合成培养基中加入添加物构成；其中：所述的添加物及其用量为： 胰岛素：５－５０ｍｇ／Ｌ，转铁贴蛋白：５－５０μｇ／ｍＬ，亚硒酸钠：１０－１００ｎＭ，乙醇氨：１０－１００μＭ，Ｌ－谷氨酰胺：４－８ｍＭ，脂类溶液：适量，腐胺：１０－１００ｍｇ／Ｌ、胰岛素类因子ＩＧＦ－１：１０－５００μｇ／Ｌ、酸性成纤维细胞生长因子ｒｈ－ａＦＧＦ：１０－６００μｇ／Ｌ，表皮生长因子ＥＧＦ：５－２００μｇ／Ｌ，硫酸亚铁：０．４２－０．８３ｍｇ／Ｌ，氢化可的松：１－－１０μｍｏｌ／Ｌ，维生素混合液：适量，植物水解物溶液：适量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：米力，屈颖，李玲，冯强，
申请(专利权)人：陈志南，米力，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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