用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法，属于玻璃化冷冻保存领域。该方法的操作步骤如下：（一）液体配制；（二）玻璃化冷冻；（三）解冻。本发明专利技术的用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法与现有技术相比，具有成本花费低，方法简单，不需昂贵仪器，而且冷冻保存效果好、解冻后成活率高的特点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：　（一）、液体配制：　基础液：在１００ｍｌ细胞培养液（ＤＭＥＭ液）中添加２０ｍｌ－３０ｍｌ胎牛血清（Ｖ／Ｖ）和０．５ｍｌ－１．５ｍｌ抗菌素液（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）；　玻璃化冷冻液Ⅰ：在１００ｍｌ基础液中添加２ｍｌ－４ｍｌ乙二醇（Ｖ／Ｖ）和２ｍｌ－４ｍｌ二甲基亚砜（Ｖ／Ｖ）；　玻璃化冷冻液Ⅱ：在１００ｍｌ基础液中添加３０ｍｌ－３５ｍｌ乙二醇（Ｖ／Ｖ）、３０ｍｌ－３５ｍｌ份二甲基亚砜（Ｖ／Ｖ）和０．２－０．３摩尔海藻糖；　解冻液：在１００ｍｌ基础液中添加０．２５－０．３５摩尔蔗糖；　（二）、玻璃化冷冻：　用６孔培养板培养细胞，待细胞汇合程度为８０％－９０％时先消化１孔细胞，用１．５毫升离心管收集细胞悬液，８００ｇ－１０００ｇ离心５－８分钟，去上清；接着加入１ｍｌ玻璃化冷冻液Ⅰ，再８００ｇ－１０００ｇ离心５－８分钟，去上清；然后加入０．５ｍｌ玻璃化冷冻液Ⅱ，混匀；之后，用移液器吸取２微升细胞悬液转移到一平皿的空白处；一支显微玻璃管插入其中，吸入液体至标记线处，立即将显微玻璃管投入液氮中储存；如此反复进行冷冻操作，细胞进入玻璃化冷冻液Ⅱ的时间控制在１分钟内，超过１分钟，剩余细胞不再作冷冻处理；再消化１孔细胞，重复前面步骤，直至将所有孔内细胞冷冻保存；　（三）、解冻：　首先在一平皿中放置２ｍｌ解冻液，接着从液氮中取出１支显微玻璃管，将显微玻璃管标记线的一端插入解冻液中，用食指堵住另一端，利用手指的温度驱使细胞进入到解冻液中，停留３－５分钟；之后，用口吸管将细胞转移到装有２ｍｌ基础液的另一平皿中，停留３－５分钟；最后将细胞转移到进行核移植实验的平皿中即可。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭秀文，万发春，刘晓牧，宋恩亮，游伟，吴乃科，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]