岩藻糖基转移酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及岩藻糖基转移酶及其应用。具体地，本发明专利技术涉及来自大肠杆菌血清群O126的核酸以及氨基酸序列，编码/代表一种新型α‑1,2‑岩藻糖基转移酶。本发明专利技术还提供了利用α‑1,2‑岩藻糖基转移酶生成岩藻糖基化产物，如寡糖、(糖)蛋白、或(糖)脂，尤其是在母乳中发现的寡糖如2’‑岩藻糖基乳糖的应用和方法。

【技术实现步骤摘要】
岩藻糖基转移酶及其应用本申请是申请日为2011年12月30日的题为“岩藻糖基转移酶及其应用”的中国专利申请号201180065581.1的分案申请。
本专利技术涉及一种新型岩藻糖基转移酶及其应用。
技术介绍
许多(糖)蛋白、(糖)脂、或寡糖需要特定岩藻糖基化结构的存在，以呈现特定的生物活性。例如，许多细胞间的识别机制需要岩藻糖基化寡糖：例如，为了连接细胞粘附分子如L-选择蛋白，特定的细胞结构必须包括岩藻糖基化碳水化合物。具有生物功能的岩藻糖基化结构的另一个实例是形成ABO血型系统的结构。此外，治疗性(糖)蛋白是发展最快的一类药物试剂，因此它们的药物代谢动力学性质以及稳定性归于它们的聚糖。由于它们的复杂性以及固有的化学性质，糖结合物(glycoconjugate)的化学合成是一项主要的挑战，并且具有大量困难。不同于针对自动合成仪的可商购的蛋白质和核酸，聚糖(还)不能使用一般的商业系统合成，更不必说糖结合物。除了对于控制立体化学的需求之外，特定连接键的形成仍然很困难。考虑到与糖结合物的化学合成或结合的酶/化学合成相关的复杂性，近年来的方法已使用糖基转移酶来酶促合成包括寡糖残基的(糖)蛋白以及(糖)脂。属于糖基转移酶的酶家族中的岩藻糖基转移酶，广泛地在脊椎动物、无脊椎动物、植物、以及细菌中表达。它们催化岩藻糖残基从供体(通常是二磷酸鸟苷岩藻糖(GDP-岩藻糖))转移到包括寡糖、(糖)蛋白、以及(糖)脂的受体。由此得到的岩藻糖基化受体底物涉及各种生物和病理过程。基于岩藻糖的添加部位，岩藻糖基转移酶被分类为：α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶、以及O-岩藻糖基转移酶。一些α-1,2-岩藻糖基转移酶已经被识别，例如，在幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)和大肠杆菌等细菌中、在哺乳动物、漂亮新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)和曼森血吸虫(Schistosomamansoni)中、以及在植物中的α-1,2-岩藻糖基转移酶。这些酶的大多数或者不能在细菌系统中以活性形式表达、或者不能使用乳糖作为受体。在哺乳动物中，GDP-岩藻糖通过从头合成(denovosynthesis)和补救途径在细胞质中合成。随着从头合成，通过两种酶将GDP-甘露糖转化为GDP-岩藻糖，同时补救途径使用游离细胞质岩藻糖作为底物。在细胞中，GDP-岩藻糖浓缩成囊泡并被岩藻糖基转移酶识别为供体底物。然而，真核糖基转移酶的异源功能表达，尤其证明了岩藻糖基转移酶在原核表达系统中表达困难。哺乳动物，尤其是来源于原核来源的人类寡糖如HMO是未知的，因而发现了使得这些寡糖极其不同的糖基转移酶。由于许多商业上重要的寡糖、(糖)蛋白、以及(糖)脂的生物活性取决于特定岩藻糖残基的存在，因此现有技术需要有效地合成或产生具有期望的寡糖残基的糖结合物。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供工具以及方法，通过所述工具和方法，岩藻糖基化底物可以以高效、省时、以及节省成本的方式进行生产，以获得高产量的期望底物。根据本专利技术，尤其是通过提供一种多核苷酸达到了该目的，所述多核苷酸可以是，例如，分离的、重组的或合成的编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸，并且包括选自以下组中的序列或由选自以下组中的序列组成，该组由以下各项组成：a)随附序列表中的SEQIDNo.1；b)与SEQIDNo.1互补的核酸序列；c)在严格条件下与a)和b)中限定的核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列。根据本专利技术的多核苷酸(参见SEQIDNo.1)是大肠杆菌菌种血清群O126的岩藻糖基转移酶。由于通过使用最新识别的岩藻糖基转移酶可以进行不能天然发生在源生物体中的反应，它们具有出乎意料的效果：在本专利技术的范围内，已经发现上述识别的α-1,2-岩藻糖基转移酶能够使用乳糖作为底物，并且能够产生岩藻糖基化寡糖，尤其是2’-岩藻糖基乳糖。至今，还没有已知的从细菌中分离的α-1,2-岩藻糖基转移酶显示使用乳糖作为天然底物用于产生岩藻糖基乳糖。因而，用于产生岩藻糖基化寡糖的最新识别的岩藻糖基转移酶的适用性极为出乎意料，因此，它的应用代表一种容易地、高效地、以及节省成本地生产诸如母乳寡糖(HMO)(如岩藻糖基乳糖)的优良工具。当今，已经表征了属于HMO的多于80种化合物的结构；它们代表一类具有益生元(prebiotic)作用的寡糖复合物。此外，HMO与上皮表位的同源结构是其对抗细菌病原体的保护性的原因。在婴儿胃肠道中，HMO选择性地提供选定的细菌菌种生长的养分，因而致使母乳喂养婴儿中的独特肠微生物群的生长。直到现在，因为这些寡糖的结构复杂性阻碍它们的合成制备，母乳仍然是HMO的主要来源。因此，需要容易地、轻松地得到HMO，这一需求可以通过使用本文中给出的出乎意料地适用的岩藻糖基转移酶提供。根据本专利技术，术语“多核苷酸”一般指的是任一种多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，所述多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸可以是未改变的RNA或DNA、或改变的RNA或DNA。“多核苷酸”包括，但不限于，单链和双链DNA，单链区和双链区混合的DNA，或单链区、双链区以及三链区混合的DNA，单链和双链RNA，以及单链区和双链区混合的RNA，包括DNA和RNA的杂交分子，所述杂交分子可以是单链的或更典型的是双链区、或三链区、或单链区和双链区的混合体。此外，本文中使用的“多核苷酸”指的是包括RNA、或DNA、或RNA和DNA的三链区。在此区域的链可以来自同一分子或来自不同的分子。该区域可以包括所有分子中的一个或多个，但更典型地只包括一些分子的一个区。三螺旋区的一个分子通常是寡核苷酸。如在本文中所使用的，术语“多核苷酸”还包括如上所述的包含一个或多个改变的碱基的DNA或RNA。因此，具有出于稳定性或其它原因改变的主链的DNA或RNA是本文中意指的术语“多核苷酸”。此外，仅举两个实例，包括稀有碱基如肌苷、或者修饰碱基如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是本文中所使用的术语多核苷酸。将理解已经对本领域技术人员熟知的用于许多有用目的的DNA和RNA进行了大量改变。如在本文中使用的术语“多核苷酸”包括如化学地、酶促地、或代谢地改变的多核苷酸的形式，以及病毒和细胞(包括，例如简单和复杂细胞)特性的DNA和RNA的化学形式。另外，“多核苷酸”还包括短的多核苷酸，通常指的是寡核苷酸。“多肽”指的是包括两个或更多氨基酸通过肽键或改变的肽键彼此连接的任一种肽或蛋白质。“多肽”不仅指的是短链，一般指的是肽、寡肽以及寡聚物；还指的是较长的链，一般指的是蛋白质。多肽可以包括除20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程如加工以及其它转录后修饰，以及通过化学修饰技术改变的那些。在基础用书(basictext)和在详细的专著中、以及在长篇研究文献中很好地描述了这些改变，并且本领域的技术人员已经熟知。将理解相同类型的改变可以以相同或不同的程度出现在给定的多肽的一些位点。另外，给定的多肽可以包括许多类型的修饰。修饰可以发生在多肽的任何部位，包括肽主链、氨基酸侧链、以及氨基端或羧基端。修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码具有α‑1,2‑岩藻糖基转移酶活性并具有将岩藻糖残基转移至乳糖的能力的多肽并且包括选自由以下各项组成的组中的序列的多核苷酸在生产2’‑岩藻糖基乳糖中的应用：a)随附序列表中的SEQ ID No.1；b)与SEQ ID No.1互补的核酸序列；c)在严格条件下与a)和b)中限定的所述核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列，或者包含所述多核苷酸的载体在生产2’‑岩藻糖基乳糖中的应用，或者具有α‑1,2‑岩藻糖基转移酶活性并具有将岩藻糖残基转移至乳糖的能力的多肽在生产2’‑岩藻糖基乳糖中的应用，所述多肽由选自以下组中的氨基酸序列组成，所述组由以下各项组成：(a)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列；(b)在SEQ ID No.2中所示的所述氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中，所述等位基因变体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下杂交至在SEQ ID No.1中所示的核酸分子的相反链；(c)在SEQ ID No.2中所示的所述氨基酸序列的同源体或具有与SEQ ID No.2至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中，所述同源体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下杂交至在SEQ ID No.1中所示的所述核酸分子的相反链；以及(d)在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的片段，其中，所述片段包括至少10个连续的氨基酸。...

【技术特征摘要】
2011.01.20 EP 11151571.41.编码具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性并具有将岩藻糖残基转移至乳糖的能力的多肽并且包括选自由以下各项组成的组中的序列的多核苷酸在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用：a)随附序列表中的SEQIDNo.1；b)与SEQIDNo.1互补的核酸序列；c)在严格条件下与a)和b)中限定的所述核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列，或者包含所述多核苷酸的载体在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用，或者具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性并具有将岩藻糖残基转移至乳糖的能力的多肽在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用，所述多肽由选自以下组中的氨基酸序列组成，所述组由以下各项组成：(a)在SEQIDNo.2中所示的氨基酸序列；(b)在SEQIDNo.2中所示的所述氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中，所述等位基因变体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下杂交至在SEQIDNo.1中所示的核酸分子的相反链；(c)在SEQIDNo.2中所示的所述氨基酸序列的同源体或具有与SEQIDNo.2至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中，所述同源体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下杂交至在SEQIDNo.1中所示的所述核酸分子的相反链；以及(d)在SEQIDNo.2中所示的氨基酸序列的片段，其中，所述片段包括至少10个连续的氨基酸。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述岩藻糖基化寡糖的生产通过编码所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的所述多核苷酸的异源或同源表达进行。3.用于生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：a).提供具有α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽，所述多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下各项组成的组：(a)在SEQIDNo.2中所示的氨基酸序列；(b)在SEQIDNo.2中所示的所述氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中，所述等位基因变体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下杂交至在SEQIDNo.1中所示的核酸分子的相反链；(c)在SEQIDNo.2中所示的氨基酸序列的同源体或具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中，所述同源...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤利娅·帕尔科特，埃里克·许夫纳，斯特凡·延内魏因，洛塔尔·埃林，勒奥尼·恩格斯，
申请(专利权)人：詹尼温生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE