海洋微生物酶法制备α‑环糊精响应面设计方法及应用技术

本发明专利技术涉及海洋微生物酶法制备α‑环糊精响应面设计方法及应用，属于海洋微生物酶领域。具体包括酶法转化的底物种类、底物浓度、来源于海洋微生物菌株Y112的α‑环糊精葡萄糖基转移酶添加量、转化温度、反应时间和反应pH，以及通过响应面法获得的最优制备方法。最优条件为：马铃薯淀粉浓度为5％，加酶量200u/g(淀粉)，pH值为8.4，温度30摄氏度，转速200转每分钟，反应6小时。该条件下α‑环糊精转化率可以达到28.67％。所述方法去掉了有机溶剂正癸醇的应用，同时保证了转化效率，且该方法工艺简单，快速效果好，用来转化淀粉制备α‑环糊精有效、可靠、经济。

Preparation of alpha cyclodextrin response surface design method and application of enzymatic preparation of marine microorganisms

The present invention relates to preparation of alpha cyclodextrin response surface design method and application of enzymatic preparation of marine microorganisms, which belongs to the field of marine microbial enzyme. Including the enzymatic conversion of substrate types, substrate concentration, strain Y112 from marine microorganisms alpha cyclomaltodextrin dosage, temperature, reaction time and pH, and the optimal preparation method to obtain the response surface method. The optimum conditions were as follows: potato starch concentration was 5%, enzyme dosage was 200u/g (starch), pH value was 8.4, temperature was 30 degrees Celsius, rotate speed was 200 rpm, reaction time was 6 hours. Under this condition alpha cyclodextrin conversion rate can reach 28.67%. The method to remove the organic solvent decanol, while ensuring the conversion efficiency, the process and the method is simple, fast and good effect, for the conversion of starch preparation alpha cyclodextrin is effective and reliable, economic.

【技术实现步骤摘要】
海洋微生物酶法制备α-环糊精响应面设计方法及应用
本专利技术涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉制备α-环糊精的响应面设计优化方法及应用。
技术介绍
环糊精(CD)是一类环状低聚糖。一般常见的有α-、β-和γ-环糊精，分别由6，7，8个D-吡喃葡萄糖单元，以α-1,4糖苷键首尾相连而成。环糊精可以包埋众多的形状各异和适当大小的疏水性客体分子，进而改变它们的稳定性、溶解度、挥发性及化学反应性能等理化性质。环糊精的化学性质均比较稳定，α-环糊精在体内的代谢作用最慢且无毒。环糊精在药品、食品、化妆品、环保、工业和农业等领域都有良好的应用前景，而且作为一种新型的膳食纤维逐渐走入人们的视野。环糊精的制备主要有两种方法：化学合成法和生物酶转化法，化学合成法因为过程复杂等原因已经被淘汰，而生物酶转化法的主要原理是利用环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉或者底物生成环糊精。CGTases酶能催化转糖基化反应，包括环化，耦合，歧化和水解反应，是一种多功能酶。大多数的CGTase生成的都是多种环糊精的混合体。Bharat等利用来自肺炎克雷伯菌AS-22分泌的CGTase酶生产α-环糊精，当CGTase作用于溶解性较好的糊精时，转化率只能达到10.9％。Duan等以15％(W/V)马铃薯淀粉为底物，每克底物同时加入10U的α-CGTase和48U的异淀粉酶，加入5％的环化反应促进剂正癸醇，温度30℃，pH5.6，反应24h后CD的总产量达到84.6％(w/w)，比单独使用α-CGTase的转化率提高了31.2％，其中α-CD、β-CD、γ-CD的重量比1.00：0.05：0.01，这是所知的同时使用α-CGTase和异淀粉酶转化CD的第一份报告，也是迄今为止环糊精生产效率最高的报道。随着近年来的不断研究，CD和CGTase的应用越来越广泛，但高成本和低产量依然是制约其应用的关键问题，因此继续研究提高环糊精产率的方法仍具有重要的意义。本专利技术对来自海洋芽孢杆菌Y112生产的α-CGTase生产α-环糊精的条件进行了优化，使得α-环糊精的产量达到较高水平。专利技术专利“海洋α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉制备α-环糊精的方法”(专利申请号201610959716.3)公开了α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉制备α-环糊精的方法，但所述方法中添加了有机溶剂正癸醇，而这一有机溶剂在食品应用中存在一定的限制。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法及应用，本专利技术是在所述专利(专利申请号201610959716.3)方法的基础上进行了部分反应条件的优化；所述方法对淀粉比例，反应温度，反应时间，酶添加量，特别是使用响应面设计优化技术进行了条件的优化试验，去掉了有机溶剂正癸醇的添加，同时保证了转化效率。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法，所述方法为确定影响α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉生成α-环糊精的主要影响因子为底物浓度、温度和pH，以此3个因素为自变量，每个因素选择3个水平，以转化率为响应值，做3因素3水平共17个试验点、5个中心点的二次回归正交组合试验，对试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得到转化率对底物浓度A、温度B和pHC的二次多项回归方程为：Y＝+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC-0.13BC-1.30A2-2.30B2-2.76C2，利用软件分析得到最大响应值时A、B、C对应的值即为最佳实验条件。进一步，通过上述响应面设计优化出最佳条件为：淀粉种类为马铃薯淀粉，淀粉浓度为5％(W/V)，海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶添加量为每克淀粉200u，pH值为8.4，温度30摄氏度，转速每分钟200转，反应6小时。该条件下α-环糊精转化率为28.67％。本专利技术还提供一种利用上述方法进行α-环糊精的酶法制备方法，其特征在于包括下列步骤：⑴取浓度为5％(W/V)的马铃薯淀粉，加热溶解至100mL水溶液；⑵取步骤⑴的淀粉水溶液冷却至30℃，调整pH为8.4后，添加海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶于淀粉水溶液中，添加比例为200U/g淀粉；⑶取步骤⑵的酶淀粉水溶液置于振荡器进行反应，振荡器转速为每分钟200转，反应时间为6小时，既得α-环糊精水溶液。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术通过转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法，得到转化率对底物浓度A、温度B和pHC的二次多项回归方程为：Y＝+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC-0.13BC-1.30A2-2.30B2-2.76C2，利用软件分析得到最佳实验条件。利用所述实验条件对α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉生成α-环糊精，获得了较高的α-环糊精转化率，可以达到28.67％，所述方法去掉了有机溶剂正癸醇的应用，且该方法工艺简单，快速效果好，用来转化淀粉制备α-环糊精有效、可靠、经济。附图说明图1底物种类对α-环糊精转化率的影响；图2底物浓度对环糊精转化率的影响；图3α-环糊精的转化率随着加酶量的增加的变化趋势；图4不同的温度对转化率的影响；图5不同作用时间对α-环糊精转化率的影响；图6不同pH对α-环糊精转化率的影响；具体实施方式下面通过实施例结合附图来对本专利技术的技术方案作进一步解释，但本发的保护范围不受实施例任何形式上限制。实施例一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法，具体方法如下：⑴底物种类：取5％浓度的玉米淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糊精和可溶性淀粉溶液各100mL加热溶解，待冷却后，温度30℃，pH值为9，加酶量200U/g淀粉，200r/min，6h取出煮沸灭活测α-CD产量。底物种类对α-环糊精转化率的影响如附图1所示。由图中可以看出，可溶性淀粉的环糊精转化率最高，麦芽糊精的转化率最低。马铃薯淀粉的转化率略低于可溶性淀粉。马铃薯淀粉的价格比较低，使得生产环糊精的成本降低，因此马铃薯淀粉在此试验是适合生产环糊精的底物。⑵底物浓度：分别取3％、5％、8％、10％、15％、20％浓度的马铃薯淀粉溶液各100mL加热溶解，待冷却后，温度30℃，pH值为9，加酶量200U/g淀粉，200r/min，6h取出煮沸灭活测α-CD产量。底物浓度对环糊精转化率的影响如附图2所示。由图可以看出当淀粉浓度5％时，α-环糊精的转化率为25.9％，当淀粉浓度升到10％时，α-环糊精的转化率和5％时相比下降50％，两者相差较大，继续增大底物浓度，转化率降低越明显。相反底物浓度越小，环糊精转化率越高，但是成本升高，总的产量过低，综合考虑，选用5％的马铃薯淀粉作为生产α-环糊精的淀粉浓度。⑶加酶量：5％浓度的马铃薯淀粉溶液100mL，温度为30℃，pH值为9，分别加入100、150、200、250、300U/g马铃薯淀粉的α-CGTase进行反应，200rpm摇床反应6h后灭活测α-CD产量。在一定范围内，α-环糊精的转化率随着加酶量的增加呈现先上升后下降的趋势，见附图3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α‑环糊精响应面设计优化方法，其特征在于所述方法为确定影响α‑环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉生成α‑环糊精的主要影响因子为底物浓度、温度和pH，以此3个因素为自变量，每个因素又选择3个水平，以转化率为响应值，做3因素3水平共17个试验点、5个中心点的二次回归正交组合试验，对试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得到转化率对底物浓度A、温度B和pH C的二次多项回归方程为：Y＝+28.58‑0.91A+0.28B‑0.83C+0.012AB+0.57AC‑0.13BC‑1.30A

【技术特征摘要】
1.一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法，其特征在于所述方法为确定影响α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉生成α-环糊精的主要影响因子为底物浓度、温度和pH，以此3个因素为自变量，每个因素又选择3个水平，以转化率为响应值，做3因素3水平共17个试验点、5个中心点的二次回归正交组合试验，对试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得到转化率对底物浓度A、温度B和pHC的二次多项回归方程为：Y＝+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC-0.13BC-1.30A2-2.30B2-2.76C2，利用软件分析得到最大响应值时A、B、C对应的值即为最佳实验条件。2.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝建华，王伟，刘均忠，孙晶晶，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37