通过利用混合原料的全发酵进行的寡糖的发酵生产制造技术

本发明专利技术公开了用于生产在其还原端包含半乳糖

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过利用混合原料的全发酵进行的寡糖的发酵生产
[0001]本专利技术涉及能够产生乳糖或在其还原端包含半乳糖
‑
β1,4
‑
葡萄糖部分的目的寡糖的细菌宿主细胞，以及涉及产生乳糖或包含末端半乳糖
‑
β1,4
‑
葡萄糖部分的目的寡糖的方法。

技术介绍

[0002]人乳包含碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。人乳的最多的级分由碳水化合物组成。人乳中碳水化合物的级分可进一步分成(i)乳糖和(ii)寡糖(人乳寡糖，HMO)。鉴于乳糖(半乳糖
‑
β1,4
‑
葡萄糖)被用作能源，寡糖却不被婴儿代谢。寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达1/10，并且可能由150多种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此无法在其他哺乳动物(包括乳场动物)的乳中大量发现。
[0003]最重要的人乳寡糖为2
’‑
岩藻糖基乳糖和3
’‑
岩藻糖基乳糖，它们共同占总HMO级分的最高达1/3。人乳中存在的其他重要的HMO为乳
‑
N
‑
四糖、乳
‑
N
‑
新四糖和乳
‑
N
‑
岩藻戊糖I。除这些中性寡糖以外，还可在人乳中发现酸性HMO，例如3
’‑
唾液酸乳糖、6
’‑
唾液酸乳糖以及3
‑
岩藻糖基
‑3’‑
唾液酸乳糖、唾液酸
‑
乳
‑
N
‑
四糖、二唾液酸
‑
乳
‑
N
‑
四糖。值得注意的是，绝大多数HMO在它们的还原端包含半乳糖
‑
β1,4
‑‑
葡萄糖部分。HMO的结构与上皮细胞表面糖缀合物的表位(Lewis组织血型抗原，例如Lewis x(LeX))是近缘的。HMO与上皮表位的结构相似性说明了针对细菌病原体的HMO保护特性。
[0004]人乳中寡糖的存在早已为人所知，几十年来一直对这些寡糖的生理功能进行医学研究。对于一些更丰富的人乳寡糖，已经确定了特定的功能。
[0005]除了本文前面提到的肠道中的局部效应外，HMO还被证明通过进入婴儿的全身循环而引起全身效应。此外，HMO对蛋白质
‑
碳水化合物相互作用(例如选择蛋白
‑
白细胞结合)的影响可调节免疫应答和减少炎症应答。此外，越来越多的人认识到HMO是婴儿微生物群发育的关键底物。
[0006]由于益生元寡糖(特别是HMO)的有益特性得到充分研究，但其天然来源的可获得性受限，因此非常需要HMO的高效的商业(即大规模)生产。
[0007]为尝试大规模生产单个人乳寡糖，开发了这些寡糖中的一些的化学途径。然而，这些方法包括使用几种有毒化学品，这增加了污染最终产物的风险。迄今为止，还不能通过化学合成提供至少足以用于食品应用的大规模数量以及质量。
[0008]为了避免与人乳寡糖化学合成相关的缺点，开发了几种酶法和发酵法用于它们的生产。已开发了用于几种HMO的发酵生产方法，所述HMO为例如2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳
‑
N
‑
四糖、乳
‑
N
‑
新四糖、3
’‑
唾液酸乳糖和6
’‑
唾液酸乳糖。这些生产方法通常使用遗传工程化的细菌菌株，如重组大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0009]如今，生产HMO的所有发酵生产方法以及生物催化反应都完全基于外源添加的乳糖作为起始底物。在这些方法中向乳糖中添加一种或多种单糖(US 7,521,212 B1；Albermann et al.,(2001)Carbohydr.Res.334(2)第97
‑
103页)。可以通过糖基转移酶或糖
苷酶，使用合适的活化单糖底物催化单糖向乳糖中的添加。此外，可以通过转葡糖苷酶反应向乳糖中添加额外的单糖。
[0010]具体地，HMO的发酵生产被证明是有效的，因为由所使用的微生物细胞的代谢提供了必需但难以合成的核苷酸活化单糖。然而，与生物催化方法相比，利用全细胞合成HMO也有几个主要缺点，这些缺点涉及跨细胞膜的转运过程、代谢副反应以及由微生物细胞合成的寡糖必须被从尤其含有各种多元醇(例如碳水化合物)、核酸、多肽、无机材料等的复杂混合物中纯化的必要性。
[0011]需要克服的涉及在发酵过程中使用乳糖(特别是当要生产的寡糖要用于人类食用时)的一个技术问题是在乳糖的热处理后，乳糖(β
‑
D
‑
半乳糖吡喃糖基
‑
(1
‑
>4)
‑
D
‑
葡萄糖)重排成乳果糖(β
‑
D
‑
半乳糖吡喃糖基
‑
(1
‑
>4)
‑
D
‑
呋喃果糖)。这种重排可以通过乳糖的热灭菌而广泛发生，从而导致在发酵培养基中或乳糖发酵进料中存在的乳糖的百分之几重排成乳果糖。然而，乳果糖是人类不可消化的糖，被广泛用作治疗慢性便秘的泻药。
[0012]乳糖向乳果糖的转化不仅导致产生不想要的乳果糖，而且为微生物细胞中的糖基化反应提供了不想要的底物。因此，产生作为副产物的更复杂的寡糖(例如2
’‑
岩藻糖基
‑
乳果糖)。因此，从乳糖产生乳果糖导致了密切相关的寡糖对所需产物的污染，所述寡糖很难或甚至不可能被从所需产物中分离。
[0013]此外，如果把乳糖提供给β
‑
半乳糖苷酶阳性大肠杆菌菌株，乳糖可以转化为异乳糖(β
‑
D
‑
半乳吡喃糖基
‑
(1
→
6)
‑
D
‑
吡喃葡萄糖)——另一种不想要的污染物(Huber et al.,“Efflux of beta
‑
galactosidase products from Escherichia coli”(1980)J.Bacteriol.141,528
‑
533)。
[0014]此外，乳糖的添加可能会引起一种被称为“乳糖诱导细胞杀伤”的有充分记载的效应。这种效应最有可能是由微生物细胞对乳糖的过度摄取和跨细菌膜的质子梯度的相关崩溃所致。特别是乳糖渗透酶基因(例如大肠杆菌的lacY)的过表达与重组微生物细胞暴露于过量乳糖相结合，可引起重组菌株的相当大的生长延迟和细胞多糖合成的增加(Grube et al.,“Hydrogen
‑
producing Esche本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖
‑
β1,4
‑
葡萄糖部分的目的寡糖的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有：
‑
至少一种葡萄糖转运蛋白，其用于将葡萄糖从培养基中转运到微生物细胞的细胞质中；
‑
UDP
‑
半乳糖生物合成途径；和
‑
至少一种β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶，其能够将游离的葡萄糖半乳糖基化以在细胞内产生乳糖。2.根据权利要求1所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述至少一种葡萄糖转运蛋白选自葡萄糖促进扩散蛋白和葡萄糖转运通透酶。3.根据权利要求1或2所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞表达或过表达至少一种编码葡萄糖转运蛋白的基因，优选至少一种选自glf、galP及其功能性变体的基因。4.根据权利要求1至3中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有磷酸葡萄糖变位酶、UTP
‑
葡萄糖
‑1‑
磷酸
‑
尿苷酰基转移酶和UDP
‑
葡萄糖4
‑
差向异构酶。5.根据权利要求1至4中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶由选自以下的基因编码：脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)lgtB、嗜沫聚集杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)lex
‑
1、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)galTpm1141及其功能性变体。6.根据权利要求1至5中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有至少一种额外的糖基转移酶，优选地选自以下的糖基转移酶：岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、葡糖胺基转移酶和半乳糖基转移酶。7.根据权利要求1至6中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞包含葡萄糖转运磷酸转移酶系统。8.根据权利要求1至7中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有果糖转运蛋白。9.根据权利要求1至8中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有果糖特异性磷酸转移酶系统，并且其中所述细胞还包含1
‑
磷酸果糖激酶。10.根据权利要求8所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞包含果糖激酶
‑
6活性和6
‑
磷酸果糖激酶
‑
1活性。11.根据权利要求9所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞包含果糖
‑
1,6
‑
二磷酸酶。12.根据权利要求9或11所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞包含其葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶的缺失或功能性失活。13.根据权利要求6至12中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述额外的糖基转移酶为岩藻糖基转移酶，并且其中所述微生物细胞具有甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酰基转移酶、GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合酶。14.根据权利要求1至13中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细
胞包含从细胞中输出目的寡糖的输出蛋白或通透酶，优选糖外排转运蛋白。...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：詹尼温生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：