从发酵液中纯化唾液酸的方法技术

本发明专利技术记载了从发酵液中分离唾液酸的有效方式。发酵液中包含的唾液酸是通过细菌发酵产生的。本发明专利技术的方法包括从发酵液中除去生物质的步骤，对所得溶液进行阳离子交换剂处理和阴离子交换剂处理中的至少一种处理的步骤，以及在离子交换剂处理后除去盐的步骤。该方法可以提供喷雾干燥形式以及唾液酸晶体形式的唾液酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从发酵液中纯化唾液酸的方法本专利技术描述了从发酵液中分离唾液酸的有效方法。发酵液中包含的唾液酸是通过细菌发酵产生的。本专利技术的方法包括从发酵液中除去生物质的步骤，对所得溶液进行阳离子交换剂处理和阴离子交换剂处理中的至少一种的步骤，以及在离子交换剂处理后除去盐的步骤。该方法可以提供喷雾干燥形式以及唾液酸晶体形式的唾液酸。唾液酸是神经氨酸的N-或O-取代的衍生物的通称，神经氨酸是一种具有九个碳的主链并具有羧酸功能的单糖。羧酸基团可以在适当的pH下为糖赋予负电荷。所有已知的唾液酸结构都衍生自四个主要核心结构(a)2-酮基-3-脱氧壬酸(Kdn)、(b)神经氨酸(Neu)、(c)N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和(d)N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，可能在C-4、C-7、C-8和C-9的羟基处具有取代(O-乙酰基、O-甲基、O-硫酸盐、O-乳酸基或磷酸基)。内酯可以出现在Neu的C-2与C-7、C-4或C-8氨基之间，或者内酰胺可以出现在C-2和C-5氨基之间。另外，还已知天然存在的脱氢唾液酸，如2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(Neu2en5Ac，也称为DANA)。诸如DANA的脱氢唾液酸可具有对唾液酸酶的抑制特性，因此具有对某些病毒(例如流感病毒)的潜在抑制特性。唾液酸通常以α-糖苷的形式存在，它占据了糖缀合物(例如糖脂和糖蛋白)中杂低聚糖的非还原性末端，并在结构和功能上提供了聚糖多样性的极端例子。唾液酸家族由九个碳的神经氨酸的40多种衍生物组成，包括N-和O-取代的衍生物。所述家族成员的结构特征是特有的，这是由于在第5位的氨基和在第1位的羧基，其在生理条件下使所有唾液酸成为带有负电荷的强有机酸。唾液酸作为脊椎动物和高等无脊椎动物的细胞表面糖缀合物(糖蛋白和糖脂)中存在的聚糖的末端糖类而存在。唾液酸也是致病性细菌的脂多糖和荚膜多糖的组分，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)K1、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、杜氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)和无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。在哺乳动物中，唾液酸被发现主要是作为细胞表面上的糖缀合物的末端残基。Neu的两种衍生物是在哺乳动物细胞上发现的最常见的唾液酸结构：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)及其羟基化衍生物、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。在哺乳动物中，人类是已知的例外，他们缺乏Neu5Gc，这是由于羟化酶(其将CMP-Neu5Ac修饰为CMP-Neu5Gc)的失活突变。在自然界中没有发现未取代形式的神经氨酸，最广泛发现的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(也缩写为“Neu5Ac”或“NANA”)。Neu5Ac是氨基的N-原子被乙酰化的唾液酸。在文献中，术语“唾液酸”有时被用作特定唾液酸Neu5Ac的同义词，但在下文中，术语“唾液酸”应被理解为所有唾液酸的家族，而Neu5Ac应被理解为所述家族的特定成员，即N-乙酰神经氨酸。Neu5Ac通过充当微生物、病毒、毒素和激素的受体来执行各种生物学功能。Neu5Ac是对细胞间的相互作用来说重要的氨基糖的特征性组分。另一个重要的自然存在的变异是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，它是通过用羟基取代乙酰基的甲基部分中的一个氢原子而形成的。Neu5Gc存在于大量动物物种中，特别是在猪组织中，但是除了在患有特定类型癌症的个体中，尚未在人类组织中检测到。此外，Neu5Ac用于保护蛋白质免受蛋白酶降解。由于存在于神经细胞的膜中的神经节苷脂中的Neu5Ac的浓度很高，因此Neu5Ac在神经元发育以及神经系统的功能中起着重要作用。另外，已知许多病毒病原体，例如人类流感病毒或禽流感病毒，在人类有机体的感染中利用唾液酸化的化合物。Neu5Ac、包含Neu5Ac的化合物和衍生自Neu5Ac的化合物已经用于抗病毒感染的活性物质中。进一步的研究集中在这些化合物用于确保最佳的神经元发育或预防退行性脑疾病的用途上。细胞表面分子的Neu5Ac修饰在许多生物学现象中起作用，例如蛋白质结构稳定性、细胞粘附的调节和信号转导。Neu5Ac缺乏症，例如GNE肌病，其也被称为遗传性包涵体肌病(HIBM)、有边缘液泡的远端肌病(DMRV)或Nonaka肌病，是由于唾液酸产生减少而引起的临床疾病。Neu5Ac的产生是突变导致该疾病的关键原因。从理论上讲，在该途径中的遗传阻断后替换代谢物可以缓解Neu5Ac缺乏症的症状。(Jayetal.,GeneReg.和Sys.,2009Biology3:181-190)。然而，在体内Neu5Ac生物合成途径中给予一种或多种化合物是一项重大挑战。这些化合物具有超快的清除率，并在其可被代谢之前在尿液中排出。在人体内，可以发现大脑中Neu5Ac的浓度最高，其中Neu5Ac作为神经节苷脂结构的主要部分参与突触形成和神经传递(Wangetal.,EurJClinNutr.2003Nov；57(ll):1351-69)。特别是在生命的第一年，Neu5Ac似乎在大脑发育中起着重要作用。婴儿大脑的快速生长对饮食的营养供应提出了异常高的需求，特别是对于早产儿来说。Neu5Ac是大脑神经节苷脂和多聚唾液酸(polySia)链的基本组分，它们修饰神经细胞粘附分子(NCAM)。人乳中的唾液酸水平很高，主要是特定唾液酸Neu5Ac的水平。相反，婴儿配方物含有低水平的Neu5Ac和Neu5Gc(Wang,AnnuRevNutr.2009；29:177-222)。因此，Neu5Ac显示出用于婴儿配方物以支持婴儿大脑发育的巨大潜力。唾液酸在许多生理和病理生理过程中起着重要作用，包括胚胎神经系统的发育、转移、免疫应答的调节以及细菌或病毒的感染。唾液酸是大脑神经节苷脂和多聚唾液酸链的基本组分，它们修饰神经细胞粘附分子(NCAM)，促进细胞间相互作用、神经元向外生长、突触连接性的修饰和记忆形成。在仔猪中，富含唾液酸的饮食增加大脑唾液酸的水平，并增加两个学习相关基因的表达。因此，所述饮食还增强学习和记忆力。婴儿，特别是早产儿，由于在这个发育阶段脑的快速生长和他们的免疫系统的发育，对包括唾液酸的营养物质有很高的需求。母乳中也存在高水平的唾液酸，尤其是Neu5Ac(约0.5g/L)。相比之下，迄今为止的婴儿配方物均包含很少量或者甚至可以忽略量的Neu5Ac。除游离的Neu5Ac外，人乳还含有多种酸性即唾液酸化的低聚糖，其属于人乳低聚糖(HMOs)家族(UrashimaT.etal.,(2011)Nutritionanddietresearchprogress:Milkoligosaccharides,NovaSciencesPublishersInc,NewYork,ISBN-978-1-61122-831-1)，最值得注意的是3'-唾液酸乳糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于从发酵液中纯化唾液酸的方法，其包括以下步骤：/n从包含唾液酸的发酵液中除去生物质，其中提供了澄清溶液，/n通过对澄清溶液进行以下处理来提供纯化溶液：/n用阳离子交换剂材料进行的阳离子交换剂处理，其中所述阳离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阳离子交换剂材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和/n用阴离子交换剂材料进行的阴离子交换剂处理，其中所述阴离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阴离子交换剂材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和/n通过电渗析从纯化溶液中除去盐。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171121 EP 17202833.41.用于从发酵液中纯化唾液酸的方法，其包括以下步骤：
从包含唾液酸的发酵液中除去生物质，其中提供了澄清溶液，
通过对澄清溶液进行以下处理来提供纯化溶液：
用阳离子交换剂材料进行的阳离子交换剂处理，其中所述阳离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阳离子交换剂材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和
用阴离子交换剂材料进行的阴离子交换剂处理，其中所述阴离子交换剂处理是在其中唾液酸通过阴离子交换剂材料并存在于流穿液中的条件下进行的；和
通过电渗析从纯化溶液中除去盐。


2.根据前述权利要求的方法，其特征在于，所述方法不包括：
i)色谱分离；和/或
ii)使用乙醇和/或乙酸乙酯，任选地不包括使用有机溶剂；和/或
iii)用包含有机溶剂的溶液从固定相洗脱唾液酸的步骤；和/或
iv)使用重金属；和/或
v)将发酵液、澄清溶液和/或纯化溶液加热至高于45℃的温度的步骤。


3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，通过离心和/或过滤从发酵液中除去生物质。


4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在阳离子交换剂处理中，使用强阳离子交换剂和/或在阴离子交换剂处理中，使用强阴离子交换剂。


5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，进行所述阳离子交换剂处理以除去非特异性阳离子并用特异性阳离子替代它们，优选地用特异性阳离子H+或Na+替代它们，其中如果非特异性阳离子被H+替代，则优选地在进行进一步的处理步骤之前，将流穿液的pH调节至pH6至8，最优选地通过向流穿液中加入NaOH进行调节。


6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，进行所述阴离子交换剂步骤以除去非特异性阴离子，并用特异性阴离子替代它们，优选地用特异性阴离子Cl-或OH-替代它们，其中如果非特异性阴离子被Cl-替代，则优选地在进行进一步的处理步骤之前，将流穿液的pH调节至pH6至8，最优选地通过向流穿液中加入NaOH进行调节。


7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，通过调节澄清溶液的pH和/或盐浓度来建立唾液酸通过阴离子交换剂材料和阳离子交换剂材料的条件，优选地通过将澄清溶液的pH值调节至pH6至8来建立。


8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在阳离子交换剂处理和阴离子交换剂处理之后，纯化溶液包含唾液酸、着色物质和盐，其中所述盐优选地为NaCl。


9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在阴离子交换剂处理中，使用氯化物形式的阴离子交换剂材料，和/或在阳离子交换剂处理中，使用氢形式的阳离子交换剂材料。


10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，首先对澄清溶液进行阳离子交换剂处理，然后进行阴离子交换剂处理。


11.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，浓缩纯化溶液，优选地通过纳滤和/或反渗透，更优选地通过纳滤来进行浓缩，其中最优选地使用截留分子量为100至200kDa的纳滤膜。


12.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，浓缩澄清溶液和/或纯化溶液，
i)直至唾液酸的浓度≥100g/L，优选地≥200g/L，更优选地≥300g/L；和/或
ii)其通过在＜80℃的温度下的纳滤来进行，优选地＜50℃，更优选地4℃至45℃，更优选地10℃至40℃，甚至更优选地15至30℃，最优选地15至20℃；和/或
iii)其通过在20℃至50℃的温度下的反渗透来进行，更优选地30℃至45℃，最优选地35℃至45℃；和/或
iv)其在＞5巴和＜50巴的压力下进行，优选地在＞10巴和＜40巴的压力下，更优选地在＞15巴和＜30巴的压力下。


13.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，电渗析是在中性条件下的电渗析或在酸性条件下的电渗析。


14.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在从纯化溶液中除去盐之后，
i)纯化溶液中盐的量为＜10％(w/w)，优选地＜5％(w/w)，更优选地＜1％(w/w)；和/或
ii)电导率为0.2至10.0mS/cm2，优选地为0.4至5.0mS/cm2，更优选地为0.5至1.0mS/cm2。


15.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，对澄清溶液和/或纯化溶液进行脱色步骤，优选地通过使用活性炭进行的处理来进行脱色，其中所述除去任选地
i)在澄清溶液的渗滤和/或浓缩步骤之前或之后进行；和/或
ii)在澄清溶液的电渗析和/或渗滤步骤之前或之后进行。


16.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，将所述澄清溶液和/或纯化溶液中包含的唾液酸转化成其钠形式，优选地通过用钠形式的强阳离子交换剂材料处理纯化溶液来进行转化。


17.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，将纯化溶液喷雾干燥，其中所述纯化溶液优选地包含钠形式的唾液酸。


18.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，对所述纯化溶液进行结晶，优选地通过将乙酸添加至纯化溶液中来进行结晶，其中特别优选地，唾液酸是以二水合物晶体的形式提供。


19.组合物，其包含
a)至少98.00重量％的唾液酸；
b)至多1.00重量％的有机溶剂；和
c)至多1.00重量％的与唾液酸的盐形式不同的盐。


20.根据权利要求19的组合物，其特征在于，所述组合物包含：
a)98.50至100重量％的唾液酸，优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·詹尼温，M·黑尔弗里希，
申请(专利权)人：詹尼温生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE