从微生物发酵获得的碳水化合物中纯化乳-N-新四糖(LNnT)的简单方法技术

提供一种从其它碳水化合物中纯化乳‑N‑新四糖的方法，其特征在于该方法包含使用不同的膜将含有乳‑N‑新四糖的水溶液进行两次膜过滤的步骤或将含有乳‑N‑新四糖的水溶液进行一次膜过滤步骤和一次连续色谱法步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从微生物发酵获得的碳水化合物中纯化乳-N-新四糖(LNnT)的简单方法
本专利技术涉及纯化乳-N-新四糖(Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)的方法。更具体地，本专利技术涉及一种用于从其它碳水化合物中分离乳-N-新四糖的简单且经济的方法，这些碳水化合物为例如乳-N-三糖、乳糖和单糖以及较大的寡糖例如对-乳-N-新六糖，对于通过微生物发酵来制备乳-N-新四糖来说，这些碳水化合物被认为是发酵液中的杂质碳水化合物。
技术介绍
人乳被认为是婴儿发育的最佳饮食。它由脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和复合寡糖组成。除乳糖外，人乳以及其它哺乳动物的乳还含有各种结构各异的寡糖，它们被称为人乳寡糖(HMO)(UsashimaT.等，(2011)MilkOligosaccharides，NovaBiomedicalBooks，NewYorkISBN978-1-61122-831-1)。由于HMO对胃肠道菌群发育的有益特性，通过化学方法或基于生物技术的方法来制备HMO的努力引起了广泛关注，因此提倡将其用于营养产品(尤其是婴幼儿营养产品以及医疗和成人营养产品)。除了这些益生菌特性外，迄今为止还观察到HMO的许多其它有益效果，扩大了其应用领域(MorrowA.L.&Yu，Y.(2017)PotentialpublichealthimpactofhumanmilkOligosaccharides.In：Prebioticsandprobioticsinhumanmilk.McGuire，M.，McGuire，M.&Bode，L.(Eds.)AcademicPress，London，pp207-222)。有限的供应以及获得单个人乳寡糖纯级分的难度，导致这些复杂分子中的一些分子的化学合成方法得到发展。然而，通过化学合成、酶促合成或发酵来合成人乳寡糖，仍然具有挑战性。时至今日，对于大规模量的生产制造，以及制造对于食品应用而言是足够量的人乳寡糖，仍然是有难度的。由于化学合成人乳寡糖过程中带来的诸多挑战，现已发展几种酶促方法和发酵方法。特别地，发酵方法需要从含有几百种不同分子的高度复杂的发酵液中纯化目标寡糖。发酵液中碳水化合物级分由单糖以及寡糖的复杂混合物组成，包括底物(例如乳糖以及作为碳源的其它糖类)、生物合成中间体、各类单糖、代谢副产物以及由微生物合成的其它多糖。此外，发酵液中出现的许多寡糖的结构是未知的(例如，由合成宿主天然产生的寡糖，譬如细胞表面糖基化结构)。因此，在很多情况下，生物技术产品的纯化比其发酵生产要昂贵得多。特别地，乳-N-新四糖的发酵通常会伴随有乳-N-三糖II的过量合成，它是乳-N-新四糖的生物合成过程的生物合成中间体，通常由细胞输出至介质中。可以通过糖苷酶处理或纯化过程中的色谱分离步骤除去发酵液中的乳-N-三糖II。由于乳-N-新四糖的非还原端有β-1,4-连接的半乳糖残基，非还原端十分类似于乳糖，其通常通过微生物发酵菌株中存在的糖基转移酶或生物催化反应中使用的糖基转移酶引起进一步的糖基化反应。这导致生成戊糖、己糖、庚糖以及甚至更大的寡糖(目标乳-N-新四糖产物的过糖基化)。此外，碳水化合物(例如乳糖)的高压灭菌(热处理)会导致生成不希望的副产物例如羟醛或mayard产物，或重排反应(例如乳糖转化为乳果糖)。最终产物中此类杂质的存在(特别是大量存在)是不想要的或者是不可接受的。从发酵液中纯化单个寡糖的“现有技术”方法，从技术层面而言是复杂的而且通常是不经济的，尤其是当所述寡糖用于食品时。对于从复杂混合物例如乳清或糖浆中纯化二糖乳糖或蔗糖而言，已经开发了涉及多个结晶步骤的工业规模方法。然而，所述方法需要精细操作，并且仅导致低产率。此外，这些方法不适用于使糖适合用于食品工业，因为乳清和糖浆已经是食品。然而，过滤方法例如超滤、微滤和纳滤在技术上很容易进行，如果所有的工艺参数都是已知和已优化的。渗滤是另一种合适的方法，其涉及向溶液中添加新鲜的水以除去膜可渗透的组分。超滤和微滤通常用于从发酵液或水溶液中分离更大的分子，例如蛋白质或细胞。此外，通过纳滤除去水、矿物质和非常小的分子是众所周知的，并且在乳制品行业中使用纳滤来进行乳清的浓缩和去矿化。在大多数情况下，用于纳滤和超滤的膜材料基于例如哌嗪、聚酰胺、聚醚砜、聚乙二醇和陶瓷等材料。可以将膜组装成例如中空纤维组件、螺旋缠绕组件和平板膜，不同的组装方式会导致不同的分离性能。通常，纳滤膜的截留分子量为150-300道尔顿。截留分子量为400-600道尔顿的膜非常罕见，特别是对于大规模工业生产。这使得寡糖的分离仍然很复杂，因为需要其它分离技术，例如分批或连续的色谱法。为了通过微生物发酵生产人乳寡糖，需要使用重组微生物(重组细菌或酵母菌株)。它们的使用会导致发酵液被来源于微生物的重组材料例如核酸分子或多肽所污染。然而，监管机构或当今的消费者都无法接受重组DNA和蛋白质对人类食用产品的污染。因此，任何来源于重组微生物的核酸和蛋白质都需要从目标人乳寡糖中除去。如今，重组DNA分子的检测限非常低，因此需要详尽彻底的纯化方案。对于基于qPCR的DNA检测而言，甚至一个DNA分子也可以从样品中检测出来。使用色谱法纯化乳-N-新四糖以及紧密相关的人乳寡糖乳-N-四糖(Galβ1-3GlcNAcβ1-3-Galβ1-4Glu)，特别是凝胶过滤色谱法(Dumon等，(2001)InVivoFucosylationoflacto-N-neotetraoseandlacto-N-neohexaosebyHeterologousExpressionofHelicobacterpyloriα1,3-FucosyltransferaseinEngineeredEscherichiacoli.Glycoconj.J.18，465-474；Priem等，(2002)Anewfermentationprocessallowslarge-scaleproductionofhumanmilkoligosaccharidesbymetabolicallyengineeredbacteria.Glycobiology12，235-240；Baumgartner等(2014)Synthesisofthehumanmilkoligosaccharidelacto-N-tetraoseinmetabolicallyengineered，plasmid-freeE.coli.Chembiochem15，1896-1900)。鉴于凝胶过滤色谱法是一种方便的实验室规模方法，只有模拟移动床色谱法代表一种与食品生产兼容的规模纯化LNnT的合适方法。然而，所有其它公开的方法都存在以下问题：不能有效从目标产物中除去杂质碳水化合物，尤其是与过度糖基化有关的碳水化合物。因此，本专利技术的目的是提供一种从微生物发酵液中纯化乳-N-新四糖的简单且具有成本效益的方法，其中除了从目标寡糖中移除所述其它碳水化合物外，还移除来源于重组微生物的核酸与多肽。已经开发几种使用工程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从其它碳水化合物中纯化乳-N-新四糖的方法，其特征在于，该方法包含使用不同的膜将含有乳-N-新四糖的水溶液进行两次膜过滤的步骤，其中/n-一个膜的截留分子量在约300至约500道尔顿之间，且/n-另一个膜的截留分子量在约600至约800道尔顿之间。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180507 EP 18171114.41.一种从其它碳水化合物中纯化乳-N-新四糖的方法，其特征在于，该方法包含使用不同的膜将含有乳-N-新四糖的水溶液进行两次膜过滤的步骤，其中
-一个膜的截留分子量在约300至约500道尔顿之间，且
-另一个膜的截留分子量在约600至约800道尔顿之间。


2.根据权利要求1所述的方法，其中水溶液是从用于制备乳-N-新四糖的发酵或酶促方法中得到的。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中水性介质是通过发酵并从发酵液中分离生物质而得到的。


4.根据权利要求3所述的方法，其中从发酵液中分离生物质包含至少一个超滤步骤，优选两个超滤步骤，更优选地，使用具有截留分子量为约500kDa的膜进行第一次超滤且使用具有截留分子量为约150kDa的膜进行第二次超滤。


5.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中水性介质用优选为H+形式的阳离子交换树脂和优选为Cl-形式的阴离子交换树脂进行处理，更优选在将水溶液进行膜过滤步骤之前进行。


6.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该方法还包括渗析步骤，优选电渗析步骤。


7.一种从其它碳水化合物中纯化乳-N-新四糖的方法，其特征在于，该方法包括使用截留分子量在约300至约500道尔顿之间的膜将含有乳-N-新四糖的水溶液进行膜过滤的步骤，并将水溶液进行连续色谱法以从水溶液中除去分子量大于LNnT的碳水化合物的步骤。


8.根据权利要求7所述的方法，其中将膜过滤步骤后的渗余物进行连续色谱法处理。


9.一种从其它碳水化合物中纯化乳-N-新四糖的方法，其特征在于，该方法包括使用截留分子量在约600至约800道尔顿之间的膜将含有乳-N-新四糖的水溶液进行膜过...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·詹尼温，M·黑尔弗里希，
申请(专利权)人：詹尼温生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE