唾液酸转移酶及其在生产唾液酸化低聚糖中的用途制造技术

本申请公开了用于生产唾液酸化低聚糖的方法、遗传工程化的细胞、唾液酸转移酶和编码所述唾液酸转移酶的核酸分子，以及所述唾液酸化低聚糖用于提供营养组合物的用途。

Sialidotransferase and its application in the production of sialylated oligosaccharides

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】唾液酸转移酶及其在生产唾液酸化低聚糖中的用途本专利技术涉及唾液酸转移酶、其在生产唾液酸化低聚糖中的用途，以及涉及所述唾液酸化低聚糖在提供营养制剂中的用途。
技术介绍
到目前为止，已经鉴定出150多种结构不同的人乳低聚糖(HMO)。虽然HMO只占总人乳营养物中的少量，但在过去几十年中，它们对母乳喂养婴儿的发育的非常有益的作用变得显而易见。人乳中总HMO含量的最高达20％是酸性的。因此，这些HMO分子具有至少一个唾液酸部分。虽然人乳中含有的唾液酸中只有3％能够以游离形式获得，但23％和74％分别与(糖-)蛋白和低聚糖结合。唾液酸家族中最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。作为低聚糖的一部分，N-乙酰神经氨酸通常导致糖的生物活性。观察到唾液酸化的HMO(SHMO)支持对病原体的抗性和肠道的抗性。值得注意的是，最近的研究进一步证明了长链SHMO抵御坏死性小肠结肠炎——早产儿中最常见和最致命的疾病之一——的保护作用。此外，SHMO被认为支持婴儿的大脑发育及其认知能力。虽然不同供体之间HMO谱的广泛变化阻碍了对酸性低聚糖的绝对定量，特别是影响了唾液酸乳-N-四糖的结构异构体，但最丰富的酸性HMO为3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、唾液酸乳-N-四糖a(LST-a)、唾液酸乳-N-四糖b(LST-b)和唾液酸乳-N-四糖c(LST-c)和二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)。关于唾液酸化HMO的结构复杂性(图1)，它们的化学或(化学)酶法合成具有挑战性，并涉及许多困难，例如，立体化学的控制、特定连接的形成、原料的可用性。最后，尽管这类合成方法的集合可成功的用于一些SHMO，但它们的昂贵性和令人不满意的产量限制了用于商业目的唾液酸化HMO的成本效益生产。一般来说，对微生物的代谢工程化以生产HMO代表了以工业规模生产HMO的最有前途的方法，并且已经被开发用于生产2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖和3’-唾液酸乳糖。然而，生产HMO的生物合成途径的工程化往往受限于参与所需HMO生物合成的糖基转移酶(例如，岩藻糖基-、半乳糖基-、N-乙酰-葡糖胺基-或唾液酸转移酶)的特异性和活性，特别是在异源表达系统(如重组细菌细胞)中时。不幸的是，编码人唾液酸转移酶的基因几乎不在原核微生物中表达。因此，这些基因和酶不适用于使用遗传工程化的细菌菌株(如大肠杆菌(Escherichiacoli))来生产唾液酸化HMO的生物技术方法。到目前为止，已经鉴定和表征了几种来自细菌菌种的唾液酸转移酶(SiaT)，例如来自奈瑟氏菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、螺旋杆菌属(Helicobacter)和发光杆菌属(Photobacterium)以及来自哺乳动物和病毒。根据蛋白质序列相似性，唾液酸转移酶通常被分为六个糖基转移酶(GT)家族。其中所有真核和病毒唾液酸转移酶被分组为GT家族29，而细菌SiaT则被包含在GT4、GT38、GT42、GT52或GT80组中。此外，唾液酸转移酶和多唾液酸转移酶可因它们形成的键而区分为，例如α-2,3-、α-2,6-和α-2,8-唾液酸转移酶。所有这些唾液酸转移酶将唾液酸残基从胞苷5’-单磷酸唾液酸(例如CMP-Neu5Ac)转移到多种受体分子，通常是半乳糖-(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GalNAc)部分或其他唾液酸(Sia)部分。几种细菌唾液酸转移酶在过去已得到充分表征，并且已经被证明适合于生产3’-SL或6’-SL。人们对使得能够合成唾液酸化的五糖或六糖(如LST-a、LST-b或DSLNT)的唾液酸转移酶知之甚少，从而限制了建立用于生产这些SHMO中任何一种的生产方法。因此，无法获得高纯度的这些所需低聚糖，阻碍了对其健康有益特性的广泛科学评估。因此，需要一种具有成本效益的方法来大量且高纯度地生产一种或多种SHMO，特别是具有一个或两个唾液酸残基的四糖、五糖和六糖。
技术实现思路
除其他外，本专利技术的目的尤其是通过鉴定和表征新的唾液酸转移酶及其在通过全细胞发酵或生物催化生产唾液酸化人乳低聚糖中的用途而得以解决的。根据第一方面，本申请提供了一种用于生产唾液酸化低聚糖的方法，其中一种遗传工程化细胞被用于生产所述唾液酸化低聚糖。所述遗传工程化细胞包含至少一种异源的唾液酸转移酶，其能够将唾液酸残基从供体底物转移到受体分子，其中所述受体分子选自乳糖、LNT-II和人乳低聚糖。根据第二方面，本申请提供了一种用于生产唾液酸化低聚糖的方法的遗传工程化细胞，其中所述遗传工程化细胞已被遗传工程化以表达异源的唾液酸转移酶，该唾液酸转移酶能够将唾液酸残基从供体底物转移到受体分子，其中所述受体分子选自乳糖、LNT-II和人乳低聚糖。根据第三方面，本申请提供了一种用于在细胞中增殖时表达异源的唾液酸转移酶的重组核酸分子，其中所述唾液酸转移酶能够将唾液酸残基从供体底物转移到受体分子，其中所述受体分子选自乳糖、LNT-II和人乳低聚糖。根据第四方面，本申请提供了能够将唾液酸残基从供体底物转移到受体分子的唾液酸转移酶，其中所述受体分子选自乳糖、LNT-II和人乳低聚糖。根据第五方面，本申请提供了能够将唾液酸残基从供体底物转移到受体分子的唾液酸转移酶用于生产唾液酸化低聚糖的用途，其中所述受体分子选自乳糖、LNT-II和人乳低聚糖。根据第六方面，本申请提供了一种通过体外生物催化生产唾液酸化低聚糖的方法，其中使用唾液酸转移酶，所述唾液酸转移酶能够将唾液酸残基从供体底物转移到受体分子，其中所述受体分子选自乳糖、LNT-II和人乳低聚糖。根据第七方面，本申请提供了通过根据第一方面的方法或根据第六方面的方法生产的唾液酸化低聚糖。根据第八方面，本申请提供了根据第七方面的唾液酸化低聚糖用于制备营养组合物的用途。根据第九方面，本申请提供了一种营养组合物，其含有至少一种根据第七方面的唾液酸化低聚糖。根据第十方面，本申请提供了一种婴儿配方物，其含有至少一种唾液酸化人乳低聚糖。附图说明图1描述了人乳中最丰富的酸性低聚糖的化学结构：3’-SL(A)、6’-SL(B)、LST-a(C)、LST-b(D)、LST-c(E)和DSLNT(F)。图2示出了过表达唾液酸转移酶基因的质粒pDEST14和pET11a的图谱。图3示出了由于合适的唾液酸转移酶的过表达而进行的唾液酸乳-N-四糖-a和唾液酸乳-N-四糖-b的体内生产(用箭头标记)，其中描述了通过薄层色谱法对过表达siaT9或siaT19的大肠杆菌BL21(DE3)#2130细胞的胞内级分进行分离。具体实施方式为了鉴定适用于制备唾液酸化HMO的方法的唾液酸转移酶，对核酸数据库和蛋白质数据库进行了检索。通过与已知的糖基转移酶的序列相似性，鉴定出100种推定的唾液酸转移酶。评估所述推定的唾液酸转移酶的唾液酸转移酶活性。...

【技术保护点】
1.一种用于生产唾液酸化低聚糖的方法，该方法包括以下步骤：/na)提供至少一种遗传工程化的细胞，其包含一种异源的唾液酸转移酶，所述异源的唾液酸转移酶能够具有α-2,3-唾液酸转移酶活性和/或α-2,6-唾液酸转移酶活性，用于将唾液酸残基从作为供体底物的其核苷酸激活的形式转移到受体分子中，其中所述受体分子选自乳糖、乳-N-三糖II和人乳低聚糖；/nb)在发酵液中并在允许生产所述唾液酸化低聚糖的条件下培育所述至少一种细胞；以及任选地/nc)回收所述唾液酸化低聚糖。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170726 EP 17183391.61.一种用于生产唾液酸化低聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供至少一种遗传工程化的细胞，其包含一种异源的唾液酸转移酶，所述异源的唾液酸转移酶能够具有α-2,3-唾液酸转移酶活性和/或α-2,6-唾液酸转移酶活性，用于将唾液酸残基从作为供体底物的其核苷酸激活的形式转移到受体分子中，其中所述受体分子选自乳糖、乳-N-三糖II和人乳低聚糖；
b)在发酵液中并在允许生产所述唾液酸化低聚糖的条件下培育所述至少一种细胞；以及任选地
c)回收所述唾液酸化低聚糖。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述唾液酸化低聚糖选自3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、LST-a、LST-b、LST-c和DSLNT。


3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述发酵液中包含至少一种碳源，所述至少一种碳源优选地选自葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油及其组合。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述发酵液中包含选自N-乙酰葡糖胺、半乳糖和唾液酸中的至少一种。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞是在不存在和/或不添加选自N-乙酰葡糖胺、半乳糖和唾液酸中的一种或多种的情况下培养的。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞是在存在选自乳糖、乳-N-三糖II、LNT和LNnt中的至少一种的情况下培养的。


7.一种用于产生唾液酸化低聚糖的遗传工程化的细胞，其中所述遗传工程化的细胞包含异源的唾液酸转移酶，所述异源的唾液酸转移酶能够具有α-2,3-唾液酸转移酶活性和/或α-2,6-唾液酸转移酶活性，用于将唾液酸残基从作为供体底物的其核苷酸激活的形式转移到受体分子中，其中所述受体分子选自乳糖、乳-N-三糖II和人乳低聚糖。


8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法或根据权利要求7所述的遗传工程化的细胞，其中所述受体分子为人乳低聚糖，其选自三糖、四糖和五糖，优选地选自3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、唾液酸乳-N-四糖a、唾液酸乳-N-四糖b、乳-N-岩藻戊糖I和乳-N-岩藻戊糖II。


9.根据权利要求1至6或8中任一项所述的方法，或根据权利要求7或8所述的遗传工程化的细胞，其中所述异源的唾液酸转移酶选自：
i.包含SEQIDNO:1至33中任一项所代表的氨基酸序列或由其组成的多肽；
ii.包含与SEQIDNO:1至33中任一项所代表的任一种氨基酸序列具有至少80％的序列相似性的氨基酸序列或由其组成的多肽；和
iii.i和ii中任一种多肽的片段。


10.根据权利要求1至6或8至9中任一项所述的方法，或根据权利要求7至9中任一项所述的遗传工程化的细胞，其中所述的遗传工程化的细胞包含含有编码异源的唾液酸转移酶的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列选自：
i.编码SEQIDNO:1至33中任一项所代表的多肽的核苷酸序列；
ii.SEQIDNO:34至66中任一项所代表的核苷酸序列；
iii.与编码SEQIDNO:1至33中任一项所代表的多肽的一种核苷酸序列具有至少80％的序列相似性的核苷酸序列；
iv.与SEQIDNO:34至66中所代表的任一种核苷酸序列具有至少80％的序列相似性的核苷酸序列；
v.与i、ii、iii和iv中任一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；和
vi.i、ii、iii、iv和v中任一种核苷酸序列的片段，其中所述核苷酸序列可操作地连接到至少一种核酸表达控制序列，所述核酸表达控制序列影响在遗传工程化的细胞中所述编码异源的唾液酸转移酶的核苷酸序列的转录和/或翻译。


11.根据权利要求1至6或8至10中任一项所述的方法，或...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·詹尼温，D·瓦滕伯格，
申请(专利权)人：詹尼温生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE