一种透明质酸的发酵生产工艺制造技术

本发明专利技术属于生物发酵技术领域，公开了一种透明质酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：将兽疫链球菌种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养6h，然后往发酵罐中添加甘油和乙醛，继续发酵培养8‑10h，再进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵。本发明专利技术在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，提高了透明质酸的产量。

A fermentation technology of hyaluronic acid

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸的发酵生产工艺
本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一种透明质酸的发酵生产工艺。
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid,HA)化学名称为糖醛(玻璃)酸,它是以D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖单体为结构单元，通过β-1,4糖苷键反复交替连接而形成的链状高分子酸性粘多糖。HA通常溶于水,不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂,具有保湿、抗衰老、润滑等功能,广泛用于日化、保健食品、医药等领域；如在医药领域,HA在药物中可作为药物载体，可将各类药物靶向送至病理部位,具有促进骨折愈合及一定抗癌作用等功效。透明质酸是一种性能优良的生化物质,应用极其广泛。其生产方法由最初的提取法发展到了微生物发酵法。这几十年来，发酵法生产透明质酸得到了迅速的发展，是现今透明质酸生产最主要的方法。目前，已经有一些研究对发酵法进行了改进，包括混合发酵技术、控制营养组分和发酵条件以提高透明质酸代谢产物的含量；申请人之前的专利技术“CN105368912A，一种喷雾逆流法提取透明质酸钠的方法”采用两菌株混合发酵，大大提高了发酵效率，但是该方法对培养条件要求较高，可能导致不能形成优势菌株，而且产生的透明质酸包括小、中、大三种分子量的透明质酸，不能形成纯度较高的单一产品，降低了产品附加值。申请人之前的专利技术“一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法”，在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，包括添加甘油，能够对细胞膜空隙产生影响，从而会对糖链分泌的正向作用；超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；上述方法提高了透明质酸的产量、分子量。在上述研究的基础上，申请人继续对透明质酸的生产方法进行了阐明。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种透明质酸的发酵生产工艺。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种透明质酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：将兽疫链球菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养6h，然后往发酵罐中添加甘油和乙醛，继续发酵培养8-10h，再进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养过程中，通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L，控制发酵培养的温度为38-40℃，溶氧为2-4L/min。优选地，所述甘油的添加量为200-300mg/L。优选地，所述乙醛的添加量为20-30mg/L。优选地，所述超声处理的参数：超声功率分别为200-300w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s。优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨1g，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH7.1。优选地，所述兽疫链球菌种子液的制备方法包括如下步骤：将兽疫链球菌取出，接种于固体活化培养基，然后接种到种子培养基中培养至菌株浓度108-109cfu/ml的兽疫链球菌种子液。优选地，所述固体活化培养基的组分为：按照重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125%氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、2%琼脂、余量为无菌水。优选地，所述种子培养基的组分为：按照重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125%氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、余量为无菌水。与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：本专利技术在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，提高了透明质酸的产量。待菌株增殖到一定浓度后，氮源浓度降低，代谢不利于菌株增殖，此时再添加甘油，能够促进碳源合成透明质酸，使代谢向着有利于产物合成的方向进行，还能够增加细胞壁分泌孔隙和通透性，有助于大分子量的透明质酸合成和分泌；在发酵初期添加甘油，并不能提高透明质酸的表达量，可能在发酵初期，菌株增殖迅速，但是透明质酸的合成较少。通过玉米浆来替代部分蛋白胨，可以降低成本，而且透明质酸产量有所提高。大规模发酵培养中，会出现氧气不充足的情况，菌株会利用糖产生乙醛等，培养基中添加合适浓度的乙醛，会对乙醛代谢途径造成反馈抑制，使得糖酵解途径的流量最大限度进入透明质酸合成途径，合成较多及较高聚合度的透明质酸。超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；选择合适的超声时间和强度，有利于透明质酸的生产。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本专利技术进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。实施例1一种透明质酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：将兽疫链球菌ATCC39920取出，接种于固体活化培养基（重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125%氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、2%琼脂、余量为无菌水），然后接种到种子培养基（重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125%氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、余量为无菌水）中培养至菌株浓度108cfu/ml的种子液；将种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨1g，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH7.1，温度38℃，溶氧3.2L/min；发酵培养6h，往发酵罐中添加甘油和乙醛，控制甘油的浓度为200mg/L，乙醛的浓度为30mg/L；继续发酵培养10h，然后超声处理，超声处理的参数：超声功率分别为200w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s；然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养总时间为18h；发酵过程中，通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。实施例2一种透明质酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：将兽疫链球菌ATCC39920取出，接种于固体活化培养基（重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125%氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、2%琼脂、余量为无菌水），然后接种到种子培养基（重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125%氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、余量为无菌水）中培养至菌株浓度108cfu/ml的种子液；将种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨1g，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH7.1，温度39℃，溶氧3.2L/min；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种透明质酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：/n将兽疫链球菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养6h，然后往发酵罐中添加甘油和乙醛，继续发酵培养8-10h，再进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养过程中，通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L，控制发酵培养的温度为38-40℃，溶氧为2-4L/min。/n

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：
将兽疫链球菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养6h，然后往发酵罐中添加甘油和乙醛，继续发酵培养8-10h，再进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养过程中，通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L，控制发酵培养的温度为38-40℃，溶氧为2-4L/min。


2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述甘油的添加量为200-300mg/L。


3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述乙醛的添加量为20-30mg/L。


4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述超声处理的参数：超声功率分别为200-300w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s。


5...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾召鹏，刘元涛，赵兰坤，来凤堂，李树标，刘建阳，刘超，
申请(专利权)人：贾召鹏，
类型：发明
国别省市：山东;37