一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，该方法先将透明质酸发酵液离心，用无机盐调节上清液的电导率，经无水乙醇沉淀后用水溶解，将溶解液经活性炭脱色、离心后，再对上清液进行咔唑显色分析检测。该检测方法可直接应用于成分复杂的透明质酸发酵液中检测透明质酸的含量。该方法既简单、方便、快速，又具有较高的准确度、精确度和重现性，可为透明质酸前期工艺开发筛选最优结果提供可靠的判断依据，在筛选透明质酸高产菌株、优化菌株前期的发酵工艺以及菌株应用于实际生产后对发酵工艺进行控制方面具有重大的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及透明质酸的检测领域，具体涉及一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸，是由(1-3)-2-乙酸氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖，由于其独特的生理学活性，使其在化妆品工业、临床治疗等领域得到了广泛的应用。近年来，微生物发酵生产透明质酸逐步取代了从动物组织中提取透明质酸的传统方法，如何高效、精确的检测发酵液中透明质酸的含量在筛选透明质酸高产菌株、菌株前期的发酵工艺优化以及菌株应用于实际生产后对发酵工艺进行控制方面显得至关重要。目前透明质酸的检测方法中，多利用分子与透明质酸的特异性结合来进行检测，但此类方法操作复杂，另外抗体等可与透明质酸特异性结合的分子合成困难，且成本高。如中国专利CN201010185144.0中合成了一种融合蛋白HABP-mKate，该融合蛋白和透明质酸具有较强的特异性，可用于透明质酸的检测，且HABP-mKate的合成克服了之前常用的HABP等结合蛋白只能依靠从组织中纯化、无法大规模生产且成本高等缺点，但该结合蛋白存在的合成工艺复杂、成本高等缺点。除上述方法外，目前常用的检测方法还有HPLC法、比色法、CTAB比浊法和咔唑显色法。但HPLC法对样品的纯度要求比较高，不适合大批量测定发酵液中透明质酸含量；比色法通过透明质酸与相应的试剂产生颜色反应，根据其吸光值来测算透明质酸的含量，具有专一性不强等问题，因此发酵液中含有大量杂质如发酵液中残留的小分子杂多糖、色素等，如果不经过预处理去除，都会对测定结果产生很大的干扰导致检测结果不准；CTAB比浊法利用其与透明质酸溶液反应产生混浊的特性，通过浊度与透明质酸的浓度的线性相关性测定透明质酸的含量，该方法具有受发酵液中的葡萄糖等小分子杂糖、无机盐离子等干扰比较小等优点，但该方法受发酵液中的蛋白干扰的影响比较大，因此专一性和准确性也不是很好。咔唑显色法检测透明质酸被认为是最为广泛的方法，目前药典中检测透明质酸均是采用该方法，但咔唑显色法的特异性差，透明质酸发酵液中的成分比较复杂，直接用发酵液进行咔唑显色检测，干扰因素太多，特别是发酵工艺开发初期，采用不同培养基发酵出来的透明质酸发酵液性质差别比较大，势必会影响结果的判断。因此需要建立一种既可减少杂质的影响，又可快速而精确的检测出发酵液中透明质酸含量的简便可行方法。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术所存在的问题和缺陷，提供了一种在基本除去发酵液中的残留杂糖、色素等干扰因素后，利用咔唑显色方法来定量检测透明质酸的方法，该方法可直接应用于成分复杂的透明质酸发
酵液中检测透明质酸的含量，既简单、快速和方便，又具有较高的准确度、精确度和重现性，可为透明质酸前期工艺开发筛选最优结果提供可靠的判断依据。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，包括以下步骤：(1)调节电导率：透明质酸发酵液经离心后取上清液，加入无机盐调节电导率至20～30mS/cm；(2)乙醇沉淀：向上述调电导率后的发酵液中加入无水乙醇，摇匀后，置于4～20℃下静置沉淀1～4h后离心，取沉淀物溶于水中得溶解液；(3)脱色：向上述溶解液中加入活性炭，振摇后、离心得上清液；(4)检测：取步骤(3)中的上清液采用咔唑显色定量法测定。在本专利技术的一些实施方式中，发酵液中加入的无机盐选自Na+、K+、Ca2+的氯化盐、硝酸盐或硫酸盐。在本专利技术的一些实施方式中，发酵液中加入的无机盐选自Na2SO4、NaCl、NaNO3、KCl或CaCl2。在本专利技术的一些实施方式中，无水乙醇的加入量为发酵液体积的1.5～3倍。在本专利技术的一些实施方式中，步骤(2)中水与步骤1)中发酵液的体积比为1:1。在本专利技术的一些实施方式中，步骤(3)中的振摇时间为1～30min。在本专利技术的一些实施方式中，脱色处理时溶解液中活性炭的含量为10g/L～100g/L。在本专利技术的一些实施方式中，所用的水为纯化水。在本专利技术的一些实施方式中，所用的检测透明质酸的方法是采用的国家药业行业标准中的咔唑测定医用透明质酸钠凝胶的方法进行咔唑显色定量法测定。在本专利技术的一些实施方式中，透明质酸损失率的计算方法为：配制一定浓度的HA标准品溶液，经过与处理HA发酵液相同的预处理工艺处理后，用咔唑显色法测定处理前后透明质酸的浓度，从而计算得损失率(HA的实际值为处理前HA的测定值)：HA损失量(g/L)＝处理前HA的测定值(g/L)-处理后HA的测定值(g/L)；同时，由此也可以得知依据本专利技术的方法所测定的透明质酸的实际值的计算方法为：本专利技术使用的术语“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是说，术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，“发酵液中加入的无机盐选自Na2SO4、NaCl、NaNO3、KCl或CaCl2”表示发酵液中加入的无机盐可以是Na2SO4、NaCl、NaNO3、KCl或CaCl2之中的一种，也可以是其一种以上的组合。发酵液经过离心除菌体后的上清液通过加入无机盐调电导率后，可以保证每批次发酵液的电导率相同，电导率相同的透明质酸溶液可以使得乙醇沉淀以及活性炭脱色过程中透明质酸的损失率更接近，因此，本专利技术通过调控发酵液的电导率，可以有效降低因溶液的电导率不同造成检测的误差偏差较大的问题，从而大大减小批次间的测定误差。发酵液的电导率对透明质酸的检测有一定的影响。发酵液电导率太低，乙醇沉淀处理时，发酵液中透明质酸不能完全沉淀下来，进而会导致测定结果偏低。而发酵液的电导率过大，乙醇沉淀时，发酵液沉淀透明质酸的同时，与咔唑也能发生显色反应的杂多糖也会被沉淀下来，导致测定结果偏高。本专利技术的有益效果在于：本专利技术所提供的定量检测发酵液中透明质酸含量的方法可直接应用于成分复杂的透明质酸发酵液中检测透明质酸的含量，既简单、方便、快速，又具有较高的准确度和精确度，为透明质酸前期发酵工艺摸索中表达量的测定提供了可靠的依据，同时在筛选透明质酸高产菌株、菌株前期的发酵工艺优化以及菌株应用于实际生产后对发酵工艺进行控制方面具有重大的意义。具体实施方式以下所述的是本专利技术的优选实施方式，本专利技术所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此专利技术创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本专利技术的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。本专利技术中使用的透明质酸发酵液均为枯草芽孢杆菌构建的工程菌株有氧发酵生产的。实施例1处理A：取15mL透明质酸摇瓶发酵液经过下列预处理方法处理：(1)透明质酸发酵液经8000rpm、10min高速离心除菌体后，上清液中缓慢加入Na2SO4粉末，以调节发酵液的电导率至20mS/cm；(2)发酵液中加入45mL的无水乙醇，摇匀后，置于4℃条件下静置沉淀1h后，高速离心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入15mL的纯化水，振摇至溶解；(3)溶解液中加入0.15g(1％)的活性炭，振摇1min后，8000rpm、10min高速离心后，弃除活性炭，得上清液；(4)上清液进行咔唑显色定量测定。测定方法采用国家药业行业标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)调节电导率：透明质酸发酵液经离心后取上清液，加入无机盐调节电导率至20～30mS/cm；(2)乙醇沉淀：向上述调电导率后的发酵液中加入无水乙醇，摇匀后，置于4～20℃下静置沉淀1～4h后离心，取沉淀物溶于水中得溶解液；(3)脱色：向上述溶解液中加入活性炭，振摇后，离心得上清液；(4)检测：取步骤(3)中的上清液采用咔唑显色定量法测定。

【技术特征摘要】
2015.03.30 CN 20151014423901.一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)调节电导率：透明质酸发酵液经离心后取上清液，加入无机盐调节电导率至20～30mS/cm；(2)乙醇沉淀：向上述调电导率后的发酵液中加入无水乙醇，摇匀后，置于4～20℃下静置沉淀1～4h后离心，取沉淀物溶于水中得溶解液；(3)脱色：向上述溶解液中加入活性炭，振摇后，离心得上清液；(4)检测：取步骤(3)中的上清液采用咔唑显色定量法测定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：石江水，王海刚，林小鹊，张鸿，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44