本发明专利技术属于免疫分析技术领域的一种定量检测动物源性食品中新霉素Ｂ含量试剂盒及其检测方法，该试剂盒由包被板和试剂组构成，其中该试剂组的组成为：缓冲液、底物Ａ、底物Ｂ、洗涤液、终止液、冻干液、新霉素Ｂ标准液、酶标记新霉素Ｂ抗原溶液、基质掩蔽剂。本发明专利技术具有操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低等特点，而且适用范围较广，既有经济效益又有社会效益，是一种创新性较高且具有良好的应用前景的定量检测动物源性食品中新霉素Ｂ含量试剂盒及其检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫分析
，尤其是一种定量检测动物源性食品中 新霉素B含量试剂盒及其检测方法。
技术介绍
新霉素属于氨基糖苷类药物，由链霉菌产生，可分离出A、 B、 C三种 主要成分，新霉素B是主要成分；A和C的活性比B低，但B的抗菌作用 比C强2 4倍，因此新霉素B是新霉素残留的标识物。新霉素抗菌谱广， 对革兰氏阳性菌和结核杆菌均有良好的抑制作用。在兽医临床上，新霉素 主要用于治疗畜禽细菌性肠炎，另外，新霉素还被广泛用于治疗畜禽乳腺 炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、外伤感染以及足腐烂等疾病；在畜禽 养殖上，新霉素可提高饲料利用率，促进畜禽生长。新霉素因其抗菌活力 强、作用范围广泛、用量少、价格低、口服安全性能高等优点而作为一种 常用兽药及具有发展前景的词料添加药物在畜牧业生产中广为使用。但是 其吸收毒性强，有较大的耳毒性、肾毒性，并可通过药物破坏溶酶体而引 起磷脂尿、肾小管细胞坏死和急性小管坏死引起的蛋白尿、管型尿，抗生 素后效应较强，其强度与药物浓度成正比，具有药物依赖效应。所以新霉 素在动物性食品中的残留对消费者产生较大的潜在危害，对食品卫生和公 共健康产生了威胁。伴随着新霉素在兽医临床的大量使用，特别是在饲料中大量添加所导致 的动物性食品中新霉素残留量增加，诱发继发性耐药性问题倍受关注。日本 要求调整动物产品中抗生素新霉素的最大残留限量，分别为肝脏、肌肉、脂 肪500pg/kg，肾脏10000pg/kg，牛奶500pg/kg和鸡蛋暂定标准是500昭/kg。 欧盟对新霉素建立了最大残留检测限，规定肝脏、肌肉、脂肪500pg/kg，肾 脏5000jxg/kg，牛奶1500吗/kg和鸡蛋500吗/kg。我国农业部235号公告规定 的新霉素最高残留限量为肌肉、脂肪、肝500 pg/kg，肾脏10000(ig/kg，牛 奶500 pg/kg和鸡蛋500吗/kg。目前新霉素B的测定方法有多种，如薄层层析法(TLC)、微生物法、 比色法和高效液相色谱法(HPLC)等方法。其中，国内外研究与应用较多 的是HPLC法，但是这种方法前处理过程繁琐，操作复杂，而且通常需要 专业人员进行操作，仪器设备昂贵，检测过程耗时且费用较高，不适于大量样品的现场快速检测。酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,简写ELISA)由于其特异性强，灵敏度高，准确性 好，操作简便，适于大批量样品的检测等优点越来越受到人们的青睐。虽 然很多科研机构和大专院校的科研人员对新霉素B酶联免疫分析检测方法 进行了研究，但是检测的灵敏度和试剂盒的稳定性方面离实际应用还有一 定的距离。酶联免疫吸附剂测定(ELISA)的基本原理是将酶与抗原或抗体用 交联剂结合起来，此种酶标记抗原或抗体与待测样品中相应抗体或抗原发 生特异反应，并牢固结合，在加入相应的酶的底物时，底物被酶催化生成 呈色产物，可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。由于此技 术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故而该技术具有 检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单、检测灵 敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低且采用酶联免疫检测技术定量 检测动物源性食品中新霉素B含量试剂盒及其检测方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种定量检测动物源性食品中新霉素B含量试剂盒，由试剂组和包被板构成，其中试剂组的组成为(1) .缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH7.3 7.5，使用时用二次水按1:5稀释；(2) .底物A:为含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液；(3) .底物B:为含3,3',5,5'-四甲基对二氨基联苯的二甲基亚砜溶液； (4X洗涤液为含2.5%吐温的磷酸盐缓冲液，使用时用二次水按照1:5稀释；(5) .终止液为1.25 mol/L硫酸；(6) .冻干液Tris溶于双蒸水中，盐酸调节pH7.3 7.5，加入蔗糖、 乳糖、牛血清蛋白及抗坏血酸；(7) .新霉素B标准液其新霉素B标准溶液浓度为10mg/L，使用时用 磷酸盐缓冲液稀释至100 pg/L后，再按1:5稀释六个梯度；(8) .酶标记新霉素B抗原溶液为新霉素B-辣根过氧化物酶的连接物 新霉素B-HRP，使用时用缓冲液按照1:10万倍稀释；(9) .基质掩蔽剂0.5 %BSA/PBS溶液，且其pH9.0 9.5; 包被板的构成为包被板为96孔或48孔微孔板并在微孔中包被新霉素B多克隆抗体，采用Na2C03 — NaHC03的缓冲液将多克隆新霉素B抗体稀释为包被液， 向包被板中每孔各加入包被液，室温放置过夜或者35 40 'C恒温温育2 3小时，洗涤液洗涤三次除去包被液，加入冻干液封闭0.8 1.2小时，洗 涤液洗涤四次后，冻干，3 5'C保存。而且，所述的新霉素B多克隆抗体是选用雄性日本大耳白兔进行六次 免疫，三次免疫后IO天由兔子的耳缘静脉采集血液离心获得抗血清进行效 价检测，末次免疫后采用股动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集 全部血清，采取免疫亲合层析法进行抗体纯化，所得抗体添加0.in/。(W/V) 的叠氮钠后于4'C储存备用。一种定量捡测动物源性食品中新霉素B含量试剂盒的检测方法，其 检测方法的步骤是(1) .用3 5。C低温离心进行样品前处理，得到样品提取液；(2) .打开试剂盒取出包被板，分别将各种浓度的新霉素B标准液和样品 提取液加入到包被板各自的微孔中，要双孔平行加样，然后再在各种浓度新 霉素B标准液和样品提取液各自的微孔中分别加入酶标记新霉素B抗原溶 液，震荡混匀5 10min,室温反应1 2小时；(3) .用洗涤液洗包被板3 4次，将孔内液体鬼掉，用吸水纸扣干，加入 底物A和底物B的混合液，室温下反应0.4 0.6小时;(4) .向各微孔中加入终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据 不同浓度新霉素B标准液的吸光度值绘制新霉素B的标准曲线图，对照新 霉素B的标准曲线图得到样品提取液中新霉素B的含量。而且，所述的酶标记新霉素B抗原溶液的制备方法是-(1) .将辣根过氧化物酶HRP用磷酸盐缓冲液PBS溶解，再将此酶溶 液逐滴加入到新霉素B中，形成混合液；(2) .将1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于双蒸水中，逐滴加 入到新霉素b和酶的混合液中，室温搅拌反应0.8 1.2小时，然后放于3 5'C连续搅拌过夜，形成反应液；(3) .将反应液装入透析袋，在缓冲液PBS中透析90 100小时；(4) .精确量取酶偶联物溶液的体积并测定浓度，加入硫柳汞后3 5 °C 保存。而且，所述的底物A和底物B的混合液的配比为14.6: 0.45。 而且，所述的样品前处理为将样品搅碎成均质，放于-2(TC储存备用， 取样品加入萃取液，低温离心，取部分上清液用基质掩蔽剂稀释。 而且，所述的萃取液为磷酸缓冲液PBS，其pH8 9。 本专利技术的有益效果和优点是1. 本专利技术的试剂盒具有操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、 检测成本低等特点，而且适用范围较广，主要适用于动物源性食品中新霉素B含量的定量检测，其抗体具有良好的广谱性和灵敏度，所得抗体和酶 标抗原稳定，具有常温保藏时间长的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量检测动物源性食品中新霉素Ｂ含量试剂盒，由试剂组和包被板构成，其特征在于： 其试剂组的组成为： （１）．缓冲液：为磷酸盐缓冲液，ｐＨ７．３～７．５，使用时用二次水按１∶５稀释； （２）．底物Ａ：为含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液； （３）．底物Ｂ：为含３，３′，５，５′－四甲基对二氨基联苯的二甲基亚砜溶液； （４）．洗涤液：为含２．５％吐温的磷酸盐缓冲液，使用时用二次水按照１∶５稀释； （５）．终止液：为１．２５ｍｏｌ／Ｌ硫酸； （６）．冻干液：Ｔｒｉｓ溶于双蒸水中，盐酸调节ｐＨ７．３～７．５，加入蔗糖、乳糖、牛血清蛋白及抗坏血酸； （７）．新霉素Ｂ标准液：其新霉素Ｂ标准溶液浓度为１０ｍｇ／Ｌ，使用时用磷酸盐缓冲液稀释至１００μｇ／Ｌ后，再按１∶５稀释六个梯度； （８）．酶标记新霉素Ｂ抗原溶液：为新霉素Ｂ－辣根过氧化物酶的连接物新霉素Ｂ－ＨＲＰ，使用时用缓冲液按照１∶１０万倍稀释； （９）．基质掩蔽剂：０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液，且其ｐＨ９．０～９．５； 其包被板的构成为： 包被板为９６孔或４８孔微孔板并在微孔中包被新霉素Ｂ多克隆抗体，采用Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］－ＮａＨＣＯ↓［３］的缓冲液将多克隆新霉素Ｂ抗体稀释为包被液，向包被板中每孔各加入包被液，室温放置过夜或者３５～４０℃恒温温育２～３小时，洗涤液洗涤三次除去包被液，加入冻干液封闭０．８～１．２小时，洗涤液洗涤四次后，冻干，３～５℃保存。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王硕，徐蓓，王忠斌，张燕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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