本发明专利技术公开了一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术的重组大肠杆菌，淀粉分支酶酶活达到2500U/mL，其生产的淀粉分支酶的最适pH 6.5，最适温度为40℃，在40℃条件下半衰期可达200h。利用本发明专利技术的淀粉分支酶以淀粉为底物，经过高温酸解后配成底物浓度为200g/L‑300g/L，当温度为35‑45℃，加酶量为1000‑1500U/g，反应时间为8‑12h条件下进行酶转化制备抗性糊精时，抗性成分可达60％，为实现抗性糊精的工业化生产奠定了基础。
A branched enzyme and its application in the preparation of resistant dextrin
The invention discloses a branching enzyme and its application in the preparation of resistant dextrin, belonging to the field of biological engineering technology. The invention of recombinant Escherichia coli, enzyme activity reached 2500U/mL starch branching enzyme, starch branching enzyme and its production of the most suitable pH 6.5, the optimum temperature is 40 DEG C, the half-life of up to 200H under 40 DEG C. By using the invention of starch branching enzyme with starch as substrate, after high temperature acid solution with the substrate concentration was 200g/L 300g/L, when the temperature is 35 DEG C 45, enzyme dosage of 1000 1500U/g, the reaction time of enzyme preparation of resistant dextrin 8 under the condition of 12h, the resistance components can be up to 60%, laid the foundation for the realization of industrialized production of resistance dextrin.
【技术实现步骤摘要】
一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用
本专利技术涉及一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用，属于生物工程
技术介绍
抗性糊精又叫难消化糊精，它由玉米淀粉为原料加工制成，因为其含有抗性成分，能够抵抗人体消化酶的作用，在消化道中不会被消化吸收，能直接进入大肠。同时抗性糊精作为一种低分子水溶性膳食纤维，具有膳食纤维的生理作用，同时还具有食品原材料很多特点，易于添加到加工食品中。现在抗性糊精主要应用于清凉饮料、果汁饮料、调味料、果子酱等的生产；近年来国内外研究发现其在高血糖、高血脂疾病等方面也有治疗保健作用。抗性糊精的研究最早起源于日本，并很快申请专利技术专利，随后欧洲国家和美国也开始了对抗性糊精的研究，并且申请了专利，目前应用最多的抗性糊精仍然是日本生产的Fibersol-2，其抗性含量能达90％以上，并且颜色为无色。我国在20世纪九十年代才开始对抗性糊精进行研究，1995年林勤保等以淀粉为原料制备焦糊精，并将焦糊精用α-淀粉酶处理后再用葡萄糖淀粉酶处理制备抗性糊精，并对影响产品组成成分的因素进行阐述。2006年，广东省食品研究所申请了一种抗性麦芽糊精的制备工艺的专利，它先对焦糊精用α-淀粉酶水解，然后用普鲁兰酶处理，后进行脱色离子交换和喷雾干燥得到抗性麦芽糊精，但产率都不高，基本上都是在40％45％左右。分支酶(BranchingEnzyme，简称BE，EC2.4.1.18)，属于糖苷水解酶家族(GH13)。该酶可以广泛应用于修饰淀粉，催化α-1,6糖苷键的生成；它的主要作用一方面催化供体线性α-1,4葡聚糖链的降解(直链淀粉和支链淀粉)，另一方面又可以通过α-1,6糖苷键将降解分子片段连接到受体上，形成更多的支链，从而改变淀粉的支化程度，具有重要的理化性质和生理功能。分支酶的来源主要有植物、动物和微生物。目前所发现的淀粉分支酶主要为植物来源，很难用于工业化生产。微生物来源的淀粉分支酶底物专一性高、酶活力强、分支化度大，在工业应用中具有无可比拟的优势。然而，天然菌株的产酶能力较低，限制了其在工业应用中的潜力。
技术实现思路
本专利技术第一个目的是提供一种产分支酶基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQIDNO.2所示分支酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述分支酶由SEQIDNO.1所示基因编码。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主为E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α或E.coliTOP10。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达是以pT7-7为载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌按下述方法构建：将核苷酸序列为SEQIDNO.1的淀粉分支酶基因连接到表达载体pT7-7上，然后再转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌PT7-7-T.fuBE/E.coliBL21(DE3)。本专利技术的第二个目的是提供一种应用所述基因工程菌生产淀粉分支酶的方法，是将所述基因工程菌接种含有80-100mg/L卡那青霉素的LB中振荡培养8-10h，然后按体积计，以5％的接种量转接至含有卡那青霉素的TB培养基中培，加入终浓度为0.12-0.2mm/L的IPTG，诱导36-48h。在本专利技术的一种实施方式中，诱导后离心收集菌体，破壁后离心收集上清液即为淀粉分支酶。在本专利技术的一种实施方式中，诱导培养阶段是当菌体细胞浓度达到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.12-0.2mm/L的IPTG。在本专利技术的一种实施方式中，诱导培养阶段控制温度25-30℃。本专利技术的第三个目的是提供一种抗性糊精制备方法，所述方法是以淀粉为底物，应用SEQIDNO.2所示的分支酶进行酶法转化。在本专利技术的一种实施方式中，所述的方法以淀粉为底物，先将底物进行高温酸解，再向酸解后的淀粉溶液中加入1000-1500U/g底物的淀粉分支酶，在35-50℃反应8-12小时。在本专利技术的一种实施方式中，所述高温酶解后的淀粉溶液浓度为200g/L-300g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述高温酸解是：淀粉加入5％的1mol/L的HCl溶液后在160-200℃进行高温反应，冷却过筛后抗性成分已有40％-45％。在本专利技术的一种实施方式中，所述分支酶为酶液、酶粉或表达SEQIDNO.2所示分支酶的细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述分支酶是由表达SEQIDNO.2所示分支酶的基因工程菌发酵生产的酶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程是表达所述分支酶的重组大肠杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程是携带重组质粒且表达编码所述分支酶基因的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒是pT7-7。本专利技术还提供所述方法在制备含抗性糊精的产品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术将来源于Thermobifidafusca的淀粉分支酶异源表达到大肠杆菌中，构建了一种基因工程菌，以pT7-7为表达载体，以E.coliBL21(DE3)为表达宿主，提供了一种高产淀粉分支酶的重组大肠杆菌，本专利技术菌株生产的淀粉分支酶的最适pH6-7、最适温度为35-50℃、在40℃条件下半衰期可达200h。利用本专利技术的淀粉分支酶以淀粉为底物，经过高温酸解后，配成200g/L-300g/L的底物浓度，然后在35℃-45℃条件下进行酶转化，反应时间为8-12小时，抗性糊精含量达60％。可用于食品添加剂行业。附图说明图1为5OD重组菌发酵破壁上清(摇瓶)SDS-PAGE电泳图；M:分子量标准蛋白；1，E.coliBL21(DE3)/pT7-7-t.fuBE细胞破壁上清；图2为淀粉分支酶在不同温度下的酶活；图3为淀粉分支酶在40℃下的热稳定性；图4为淀粉分支酶在不同pH值下的酶活；图5为淀粉中α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键比例；图6为抗性糊精中α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键比例。具体实施方式1、酶活测定方法：(1)配置50mm，pH6.5的磷酸缓冲液(Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4.2H2O)；鲁戈碘液(母液)：0.26g碘与2.6g碘化钾溶于10mL的容量瓶中(提前3天配置，确保碘完全溶解)，避光室温保存(6个月)。终止反应液：0.1mL的鲁戈碘液+50uL的2mol/L盐酸溶液，定容到26mL(现配现用)；底物：0.01g直链淀粉(0.1g支链淀粉)+0.2mL96％乙醇。3-4分钟后加入0.5mL，2mol/L的NaoH溶液，加入10mL的水，搅拌10min溶解淀粉，再加入0.5mL2mol/L的HCL溶液，加入pH6.5的缓冲液定容到10mL调节pH为6.5。(2)测定方法：50uL的酶液+50uL的底物，在40℃下水浴30min，在加入2mL的终止反应液，室温放置20min后660nm(直链淀粉)或530nm(支链淀粉)处测吸光值。(3)酶活定义:常温下在660nm或530nm处，吸光值每分钟降低1％为一个酶活单位。2、抗性糊精含量的测定方法：测定方法参照国标GB/T22224-2008《食品中膳食纤维的测定-酶重量法》，测定结果为质量占比，采用百分比表示，例如60g/L表示为60％。抗性糊精的得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗性糊精制备方法，其特征在于，以淀粉为底物，应用SEQ ID NO.2所示的分支酶进行酶法转化。
【技术特征摘要】
1.一种抗性糊精制备方法，其特征在于，以淀粉为底物，应用SEQIDNO.2所示的分支酶进行酶法转化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法以淀粉为底物，先将底物进行高温酸解，再向酸解后的淀粉溶液中加入1000-1500U/g底物的分支酶，在35-50℃反应8-12小时。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分支酶为酶液、酶粉或表达分支酶的细胞。4.一种产分支酶的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达SEQIDNO.2所示分支酶。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述分支酶由SEQIDNO.1所示基因编码。6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，陈晟，刘军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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