一种表达α‑氨基酸酯酰基转移酶的重组工程菌及其构建方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种表达α‑氨基酸酯酰基转移酶的重组工程菌及其构建方法和用途，本发明专利技术基因工程菌与现有技术的区别在于：是由克隆得到的saet‑QC基因插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28a(+)/saet‑QC，于宿主菌E.Coli BL21(DE3)中转化得到的重组工程菌saet‑QC 01，它具有表达α‑氨基酸酯酰基转移酶且酶活较高的特性。

【技术实现步骤摘要】
一种表达α-氨基酸酯酰基转移酶的重组工程菌及其构建方法和用途
本专利技术涉及一种基因工程菌及其表达方法和用途，特别涉及大肠杆菌构建的基因工程菌和用途，具体是一种表达α-氨基酸酯酰基转移酶基因工程菌。
技术介绍
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Alanyl-glutamine，Ala-Gln)，简称丙谷二肽，是由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺脱水缩合形成的二肽，其分子式为C8H15N3O4，分子量为217.22，丙谷二肽具有高热稳定性和高水溶性(586g/L，20℃)，在体内能够迅速地分解为L-谷氨酰胺和L-丙氨酸，具有不同于L-谷氨酰胺的理化性质，丙谷二肽克服了L-谷氨酰胺的溶解度低、热不稳定性等缺点，并能够被有效利用(血液及尿液中仅能检测到少量丙谷二肽)。常常被用作L-谷氨酰胺的替代品而应用于临床。因此采用与谷氨酰胺具有相同代谢效应且稳定性好的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺作为注射液，不但在以往的研究中获得肯定，而且已经成为目前国内外公认的替代谷氨酰胺的方法。Yokozeki等从765株细菌，206株酵母中筛选出了E.brevisATCC14234作为丙谷二肽的高产菌。Isao等研究了E.brevisATCC14234，纯化出了一种有催化产丙谷二肽能力的酶，并将该酶命名为α-氨基酸酯酰基转移酶(EAET)。α-氨基酸酯酰基转移酶是由aet基因编码的蛋白质，能够以氨基酸甲酯为酰基供体，氨基酸为亲核物质生成二肽，仅产生一种二肽副产物，也能够以氨基酸甲酯和二肽为底物生成多肽。该酶具有广谱性，除碱性氨基酸与色氨酸不适合作为α-氨基酸酯酰基转移酶的亲核物质；甘氨酸甲酯、丝氨酸甲酯、苏氨酸甲酯不适合作为α-氨基酸酯酰基转移酶的酰基供体外，其余的氨基酸组合均可由α-氨基酸酯酰基转移酶催化合成二肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达α-氨基酸酯酰基转移酶的重组工程菌及其构建方法和用途，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。本专利技术旨在提供一种α-氨基酸酯酰基转移酶的基因工程菌及其构建方法和用途，为丙谷二肽的工业生产提供更节约的生产条件，所要解决的技术问题是用基因工程的手段构建酶活高的α-氨基酸酯酰基转移酶的基因工程菌株，并通过诱导制备该酶用于丙谷二肽的生产。本专利技术基因工程菌是saet-QC01，它具有表达α-氨基酸酯酰基转移酶且酶活较高的特性。本专利技术基因工程菌由含pET28a(+)/saet-QC基因的重组表达质粒在宿主菌中转化而得，并经过卡那霉素抗性筛选和测序验证。所述的宿主菌为E.ColiBL21(DE3)，购自全式金生物技术有限公司。所述的重组表达质粒是用saet-QC基因插入到载体pET28a(+)中构建而成，载体pET28a(+)购自Novagen公司。所述的saet-QC基因是以鞘氨醇杆菌基因组为模板，运用PCR扩增技术克隆得到的。专利技术人已成功完成了saet-QC基因的克隆、重组表达质粒的构建和测序工作。构建本专利技术基因工程菌的技术方案包括引物设计、构建重组表达质粒和宿主菌转化。所述引物设计是根据已克隆得到的saet-QC基因序列，根据载体pET28a(+)的序列特征，借助PrimerPremier5.0软件设计引物如下：正向引物：5’CGGGGATCCATGAAGAACACCATCTCCTG3’，(包含一个BamHI位点)；反向引物：5’CCCAAGCTTATCTTTCAGAACAGAAAATTC3’，(包含一个HindIII位点)。所述构建重组表达质粒是以已经克隆得到的saet-QC基因为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamHI和HindIII酶切位点的基因克隆产品。将上述的克隆产品用BamHI和HindIII双酶切，酶切产品连接到载体pET28a(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET28a(+)/saet-QC。所述宿主菌转化是将pET28a(+)/saet-QC质粒转化到E.ColiBL21(DE3)感受态细胞中，经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后，获得α-氨基酸酯酰基转移酶工程菌E.ColiBL21(DE3)/saet-QC01。由本专利技术基因工程菌的发酵培养的技术方案包括接种、培养、诱导、破碎和分离，具体的说是将基因工程菌saet-QC01接种到含卡那霉素50μg/mL的50mLLB培养基中，转速250r/min，37℃培养8-15h，吸取2mL菌液加入至200mLS培养基中，转速250r/min，37℃培养，当菌浓度OD600达到1.5-2.5时，加入浓度为0.6mmol/mLIPTG诱导剂，25℃发酵诱导6-12h，离心分离得到菌体，向菌体中加入pH值为8.0-9.0的硼酸缓冲液，超声破碎后离心分离，取其上清液即得粗酶液。酶活达600-900U/mL。酶活测定具体方法为：用硼酸缓冲液配置10mL含200mmol/L的AlaOMe.HCl和200mmol/LGln，用NaOH将pH调到8.5，加入1mL的酶液，于25℃水浴2h，吸取500μL反应液，加入500μL的1.7％(v/v)H3PO4，通过高效液相检测丙谷二肽的浓度，在25℃下，1mL底物反应液中每小时催化底物丙氨酸甲酯盐酸盐和谷氨酰胺产生0.1mg丙谷二肽所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。本专利技术基因工程菌的用途是由该重组工程菌发酵制备得到的α-氨基酸酯酰基转移酶在以AlaOMe.HCl和Gln为底物制备丙谷二肽的应用。应用上述α-氨基酸酯酰基转移酶粗酶液合成丙谷二肽，步骤如下：酶反应体系配制：硼酸缓冲液配置20mL含200mmol/L的AlaOMe.HCl和200mmol/LGln，用NaOH将pH调到8.5，按50U/ml的比例加入α-氨基酸酯酰基转移酶粗酶液。将上述混合液在27℃，搅拌反应2小时，催化获得丙谷二肽。本专利技术构建的α-氨基酸酯酰基转移酶重组基因工程菌saet-QC01，具有酶活高的特性，为其更好的应用于丙谷二肽的工业生产提供了一定的基础，酶活高的特性使其可以更好的节约生产成本。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术基因工程菌与现有技术的区别在于：是由克隆得到的saet-QC基因插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28a(+)/saet-QC，于宿主菌E.ColiBL21(DE3)中转化得到的重组工程菌saet-QC01，它具有表达α-氨基酸酯酰基转移酶且酶活较高的特性。附图说明图1为本专利技术实施例5的原理示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：重组表达质粒pET28a(+)/saet-QC的构建根据已经克隆得到的α-氨基酸酯酰基转移酶基因(saet-QC)序列，按照表达载体pET28a(+)的序列特征，借助PrimerPremier5.0软件设计引物如下：正向引物：5’CGGGGATCCATGAAGAACACCATCTCCTG3’，(包含一个BamHI位点)；反向引物：5’CCCAAGCTTATCTTTCAGAACAGAAAATTC3’，(包含一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑氨基酸酯酰基转移酶重组工程菌，其特征在于：是由克隆得到的α‑氨基酸酯酰基转移酶基因(saet‑QC)插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28a(+)/saet‑QC，于宿主菌E.Coli BL21(DE3)中转化得到的重组工程菌saet‑QC 01。

【技术特征摘要】
1.一种α-氨基酸酯酰基转移酶重组工程菌，其特征在于：是由克隆得到的α-氨基酸酯酰基转移酶基因(saet-QC)插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28a(+)/saet-QC，于宿主菌E.ColiBL21(DE3)中转化得到的重组工程菌saet-QC01。2.一种权利要求1所述的重组工程菌的构建方法，包括引物设计、构建重组表达质粒和宿主菌转化，其特征在于：所述引物设计是根据已克隆得到的α-氨基酸酯酰基转移酶基因序列和载体pET28a(+)的序列特征，借助PrimerPremier5.0软件设计引物如下：正向引物：5’CGGGGATCCATGAAGAACACCATCTCCTG3’，反向引物：5’CCCAAGCTTATCTTTCAGAACAGAAAATTC3’；所述构建重组表达质粒是以已经合成的由鞘氨醇杆菌中克隆的α-氨基酸酯酰基转移酶基因序列经过密码子优化后基因为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamHI和HindIII酶切位点的基因克隆产品，将所述基因克隆产品用BamHI和HindIII双酶切，将酶切产物连接到载体pET28a(+)的双酶切位点上，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪斌，刘鹏飞，秦川，胡雪芹，
申请(专利权)人：合肥工业大学，合肥川迪医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34