一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法技术

本发明专利技术公开了一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法；该方法取裂褶菌斜面菌种采用PDA培养基试管斜面接种培育，制得发酵种子液；将种子培养液接入发酵罐中发酵，0‐36h为发酵初期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速100‐400r/min，通气量0.20‐0.8vvm，26‐28℃；37‐84h为发酵中期阶段；85‐96h为发酵后期阶段，分别控制发酵条件，发酵结束后放料，除去菌丝体；浓缩，沉淀，过滤，得精制裂褶多糖。本发明专利技术方法利用菌体自身分泌的酶对多糖进行降解，不仅将传统经发酵获得的分子量较大溶解性较差的粗多糖分离提纯后再进行降解的工序大大简化，而且提高产品收率，降低了生产成本。

A method for regulating the molecular weight of split fold polysaccharides in the fermentation products of plepleis

The invention discloses a control method of Schizophyllum pleat polysaccharide molecular weight split fermentation products; the methods of Schizophyllum slant strains by using PDA medium test tube slant inoculation cultivation, prepared seed liquid fermentation; seed fermentation liquor into the fermentation tank, approximately 0 36h for the initial fermentation stage, fermentation conditions control: stirring speed of 100 - 400r/min, 0.20 - 26 0.8vvm ventilation, approximately 28 DEG C; 37 - 84h 85 - 96h middle stage of fermentation; fermentation stage, control the fermentation conditions, fermentation after discharge, remove mycelium; concentration, precipitation, filtration, refined schizophyllan. The method utilizes the enzyme secreted by the bacteria to degrade polysaccharides, which not only simplifies and purifies the crude polysaccharide obtained by traditional fermentation, but also reduces the production rate and the production cost.

【技术实现步骤摘要】
一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法
本专利技术涉及裂褶多糖，特别是涉及一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法，具体是涉及一种利用裂褶菌发酵产裂褶多糖时体系附加产内切β-1，3-D-葡聚糖酶对多糖进行酶解从而调节发酵产物裂褶多糖分子量的技术。
技术介绍
裂褶多糖(SPG)是裂褶菌发酵得到的水溶性多糖，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性。但发酵得到的裂褶多糖的分子量大(一般为4000kDa以上)、难于重新溶解、不利于生物吸收等特性，极大的限制了其应用，需要对其进行降解，适度降低分子量，但过度降解会造成其生物活性丧失。目前现有技术都是先通过裂褶菌深层发酵获得裂褶多糖，对粗多糖进行纯化，再对多糖进行降解。目前裂褶多糖降解方法主要有化学降解法、物理降解法和生物降解法。一般裂褶多糖的化学降解法主要是酸降解，物理降解法主要是超声波降解，而其中生物酶解法是一种较好的降解方法，但很难找到一种专一性的酶来满足裂褶多糖降解改性的需要，一方面这种酶必须是β-1，3-内切葡聚糖酶，另一方面很多酶会将多糖降解成50kDa以下(产物失去活性)而不能满足要求。
技术实现思路
针对目前发酵产生的裂褶多糖分子量大，溶解性差，但又较难找到合适的酶对其进行降解改性，本专利技术利用裂褶菌发酵产裂褶多糖体系中同时附加产内切葡聚糖酶的特性，控制条件直接经发酵一步得到分子量适宜溶解性好的改性裂褶多糖。本专利技术就是利用裂褶菌在发酵过程中发酵体系本身产生的内切葡聚糖酶对发酵已产生的分子量太大的裂褶多糖进行适度降解，从而获得溶解性较好的裂褶多糖。不仅解决了专一性酶的问题，而且可在发酵罐中一步实现裂褶多糖的发酵制备及降解改性，直接获得分子量适宜溶解性好的裂褶多糖，大大简化了制备步骤并降低成本。本专利技术通过调节发酵条件，使发酵不同阶段分别进行裂褶多糖的积累和内切β‐1,3‐葡聚糖酶的合成，并使产生的内切β‐1,3‐葡聚糖酶对裂褶多糖进行酶解，实现裂褶多糖的发酵和降解改性一体化，从而通过发酵一步即获得分子量降低、溶解性好的裂褶多糖，实现裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的调控。裂褶菌液体深层发酵获得裂褶多糖，在发酵的初始阶段，通过控制适宜的发酵条件，主要使裂褶菌生长并产生裂褶多糖。随着裂褶多糖的产率的增加和碳源的消耗，通过调节发酵条件，使发酵进入中期阶段，即进一步增加多糖并同时进行内切葡聚糖酶的积累的阶段。在发酵的后期阶段，进一步调节发酵条件，使在第二阶段产生的酶对第一阶段产生的多糖进行酶解，从而获得分子量较合适，溶解度较好的裂褶多糖。本专利技术目的通过如下技术方案实现：一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法，包括如下步骤：1)发酵种子液的制备：取裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)斜面菌种采用PDA培养基试管斜面接种培育5‐7天后，得活化的斜面种子；取经活化的斜面种子在液体培养基中培养3-4天，得发酵种子液；其中，裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)斜面菌种于2014年10月购自于广东省微生物菌种保藏中心。2)裂褶菌发酵：将种子培养液接入发酵罐中发酵，0‐36h为发酵初期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速100‐400r/min，通气量0.20‐0.8vvm，26‐28℃，溶解氧DO维持在35‐45％；37‐84h为发酵中期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速200‐350r/min，调节发酵液pH为3.8‐4.5，通气量为0.5‐1.5vvm，维持DO30‐35％，温度26‐28℃，通过监测发酵罐中还原糖的含量，当葡萄糖量降至15‐18g/L范围时，向发酵罐中补充葡萄糖至发酵罐中葡萄糖含量达到20‐28g/L；共计补料3‐5次；85‐96h为发酵后期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速250‐400r/min，调节发酵液pH为4.5‐5.5，温度提高至35‐45℃，通气量为0.5‐1.0vvm，使溶氧DO维持在25‐30％，继续发酵12‐18小时；3)裂褶多糖的分离纯化：发酵结束后放料，除去菌丝体；发酵液浓缩至原来的体积的1/2‐1/4，加入乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水重新溶解，再采用分子量为50‐100kDa的超滤膜过滤除蛋白质及小分子，得精制裂褶多糖。为进一步实现本专利技术目的，优选地，所述裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)斜面菌种采用PDA培养基试管斜面接种培育是在超净台中采用接种环从斜面菌种菌丝体上取样并在PDA培养基试管斜面上划线接种，将已接种好的裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)试管斜面放入26‐28℃的培养箱中培养5-7天。优选地，所述PDA斜面培养基由如下方法制备：将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30‐40分钟，用双重纱布过滤，滤汁中加白糖与琼脂，煮沸使琼脂溶解，补足水量至1000mL，分装后0.1MPa灭菌20‐30分钟以上；每1000mL水中，马铃薯用量为200g，白糖用量为20g，蛋白胨用量为5g，琼脂用量为20g。优选地，以营养成分浓度计，所述液体培养基的组成为：葡萄糖30‐40g/L，酵母膏2.5‐3g/L，KH2PO40.5‐1.0g/L，MgSO4·7H2O0.4‐0.5g/L；按比例配制后在121℃灭菌20‐30min备用。优选地，所述取经活化的斜面种子在液体培养基中培养是用接种针挑取菌丝接入装有液体培养基中，在恒温摇床中26-28℃，180-200rpm条件下培养3-4天。优选地，所述发酵种子液以发酵罐装液量体积的8-10％接种量接入发酵罐培育，装料系数控制为0.6-0.75。优选地，所述调节发酵液pH为3.8‐4.5是采用0.2‐0.5mol/L的NaOH或HCL溶液调节。优选地，所述调节发酵液pH为4.5‐5.5是采用0.5mol/L的NaOH溶液调节。优选地，所述乙醇的体积浓度为95％；乙醇的加入量为步骤5)浓缩液体积的3‐4倍。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点和有益效果：1)本专利技术首次提出基于裂褶菌在发酵过程中自身分泌内切β‐1,3‐葡聚糖酶对产生的裂褶多糖进行同步降解改性从而获得分子量大小适宜，溶解性较好的裂褶多糖的方法。采用该专利技术方法，可以通过控制发酵不同阶段的发酵条件，分别完成裂褶菌生长、多糖的积累、内切葡聚糖酶的产生及酶对多糖的降解等步骤，从而在发酵过程中实现裂褶多糖的制备及改性，得到所需要的多糖。2)与现有裂褶多糖的降解方法相比，本专利技术方法利用菌体自身分泌的酶对多糖进行降解，不仅将传统经发酵获得的分子量较大溶解性较差的粗多糖分离提纯后再进行降解(包括化学法、超声降解法及酶法)的工序大大简化，而且提高产品收率，降低了生产成本，是一种具有工业化潜力裂褶多糖制备方法。3)与传统制备方法中的酶法相比，由于本专利技术中体系产生的酶对裂褶多糖的降解改性具有很好的专一性，可以满足对裂褶多糖适度降解的需求，产物的分子量一般都在500-1500kDa之间。而传统方法中对发酵得到的大分子裂褶多糖进行纯化后，再选用内切β-葡聚糖酶进行酶解，除了工艺流程较长外，主要问题是难以找到合适的酶，往往得到的酶解产物分子量太低，如降解至50kDa以下甚至8kDa。附图说明图1为实施例1条件下最终得到的裂褶多糖经冷冻干燥后的显微照片；图2为实施例2条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法，其特征在于包括如下步骤：1)发酵种子液的制备：取裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)斜面菌种采用PDA培养基试管斜面接种培育5‐7天后，得活化的斜面种子；取经活化的斜面种子在液体培养基中培养3‑4天，得发酵种子液；2)裂褶菌发酵：将种子培养液接入发酵罐中发酵，0‐36h为发酵初期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速100‐400r/min，通气量0.20‐0.8vvm，26‐28℃，溶解氧DO维持在35‐45％；37‐84h为发酵中期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速200‐350r/min，调节发酵液pH为3.8‐4.5，通气量为0.5‐1.5vvm，维持DO30‐35％，温度26‐28℃，通过监测发酵罐中还原糖的含量，当葡萄糖量降至15‐18g/L范围时，向发酵罐中补充葡萄糖至发酵罐中葡萄糖含量达到20‐28g/L；共计补料3‐5次；85‐96h为发酵后期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速250‐400r/min，调节发酵液pH为4.5‐5.5，温度提高至35‐45℃，通气量为0.5‐1.0vvm，使溶氧DO维持在25‐30％，继续发酵12‐18小时；3)裂褶多糖的分离纯化：发酵结束后放料，除去菌丝体；发酵液浓缩至原来的体积的1/2‐1/4，加入乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水重新溶解，再采用分子量为50‐100kDa的超滤膜过滤除蛋白质及小分子，得精制裂褶多糖。...

【技术特征摘要】
1.一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法，其特征在于包括如下步骤：1)发酵种子液的制备：取裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)斜面菌种采用PDA培养基试管斜面接种培育5‐7天后，得活化的斜面种子；取经活化的斜面种子在液体培养基中培养3-4天，得发酵种子液；2)裂褶菌发酵：将种子培养液接入发酵罐中发酵，0‐36h为发酵初期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速100‐400r/min，通气量0.20‐0.8vvm，26‐28℃，溶解氧DO维持在35‐45％；37‐84h为发酵中期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速200‐350r/min，调节发酵液pH为3.8‐4.5，通气量为0.5‐1.5vvm，维持DO30‐35％，温度26‐28℃，通过监测发酵罐中还原糖的含量，当葡萄糖量降至15‐18g/L范围时，向发酵罐中补充葡萄糖至发酵罐中葡萄糖含量达到20‐28g/L；共计补料3‐5次；85‐96h为发酵后期阶段，发酵条件控制为：搅拌转速250‐400r/min，调节发酵液pH为4.5‐5.5，温度提高至35‐45℃，通气量为0.5‐1.0vvm，使溶氧DO维持在25‐30％，继续发酵12‐18小时；3)裂褶多糖的分离纯化：发酵结束后放料，除去菌丝体；发酵液浓缩至原来的体积的1/2‐1/4，加入乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水重新溶解，再采用分子量为50‐100kDa的超滤膜过滤除蛋白质及小分子，得精制裂褶多糖。2.根据权利要求1所述的调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法，其特征在于，所述裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)斜面菌种采用PDA培养基试管斜面接种培育是在超净台中采用接种环从斜面菌种菌丝体上取样并在PDA培养基试管斜面上划线接种，将已接种好的裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)试管斜面放...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑必胜，邓娜，吴丽华，周林，周立武，刘瑞海，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44