一种微囊化hBMP‑2/Tet‑on系统的构建方法技术方案

本发明专利技术提供了一种微囊化hBMP‑2/Tet‑on系统的构建方法，包括如下步骤：S1.获取hBMP‑2基因，构建hBMP‑2‑GV347重组质粒；S2.将hBMP‑2‑GV347重组质粒转化、扩增后感染细胞，诱导，使用慢病毒载体进行包装，得到基因转染的BMSCs；S3.使用微胶囊包裹S2中得到的基因转染的BMSCs；本发明专利技术将Tet‑On系统与hBMP‑2同时构建于慢病毒载体上，可以提高两个系统的转染效率和表达，更加稳定和持续表达目的基因。转染BMSC后可以在强力霉素的作用下获得BMP‑2蛋白的稳定表达及促进BMSCs向成骨细胞分化。采用含酚基的羧甲基纤维素微囊进行包裹形成复合体，使上述系统在DOX的作用下，能稳定持续的向囊外分泌BMP‑2蛋白；停止使用DOX后，BMP‑2分泌即停止分泌。微囊中BMSCs细胞破囊后依然具备成骨分化能力，且可以在自分泌BMP‑2作用下成骨分化。

A construction method of 2/Tet microcapsulized hBMP on system

The present invention provides a method for constructing 2/Tet microcapsulized hBMP on system, which comprises the following steps: acquiring S1. hBMP 2 gene, construction of hBMP 2 recombinant plasmid GV347; S2. hBMP 2 GV347 recombinant plasmid was transformed and amplified in infected cells, inducing, packaging using lentiviral vectors obtained BMSCs gene transfection; S3. gene transfection by microencapsulation in S2 BMSCs; the Tet On system and hBMP 2 also built on the lentiviral vector, the two systems can improve the transfection and expression efficiency, more stable and continuous expression of target gene. After transfection of BMSC BMP can be obtained 2 stable protein expression and promote osteogenic differentiation of BMSCs in the role of doxycycline. Using carboxymethyl cellulose microcapsules containing phenol were wrapped to form complex, the system in the presence of DOX, can be sustained to BMP capsule exocrine protein 2; stop using DOX, BMP 2 secretion stop secretion. BMSCs cell vesicle breaking microcapsules still have osteogenic differentiation ability, and can in autocrine BMP osteogenic differentiation under the action of 2.

【技术实现步骤摘要】
一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法
本专利技术属于骨组织工程
，涉及一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法。
技术介绍
骨移植是治疗骨缺损、骨不连的金标准，目前临床上常用的骨移植材料包括自体骨、同种异体骨移植填充和组织工程骨。自体骨来源少，而异体骨费用昂贵，且有传播疾病、免疫排斥风险，都存在局限性。组织工程技术的发展为大段骨缺损的修复提供了新的方向。组织工程骨支架材料来源广泛，联合种子细胞可以促进骨再生。形成骨组织的特殊物质骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)可诱导未分化的间充质细胞(mesenehymalosteoblastcell，BMSC)定向分化为骨细胞。其中，BMP-2是应用最广泛的成骨诱度因子，其诱导异位成骨高效、稳定。有研究发现加入了rhBMP-2的骨修复材料或过表达BMP-2的骨髓间充质干细胞在动物骨缺损模型中可以提高骨缺损的修复速度、增加骨小梁数目和骨皮质强度。这说明局部表达大量BMP能促进骨生成，短期体外提高BMP-2含量有利于治疗。但人体自身分泌BMPs量非常有限，且BMPs生物半衰期短，外本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微囊化hBMP‑2/Tet‑on系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.设计目的基因hBMP‑2引物， PCR扩增、纯化后将目的基因hBMP‑2定向克隆至携带Tet‑on调控系统的GV347载体上，构建hBMP‑2‑GV347质粒；S2.将hBMP‑2‑GV347质粒转化、扩增后，与辅助质粒共感染293T细胞；收集和浓缩慢病毒液，使用慢病毒载体转染293T细胞，得到含hBMP‑2‑GV347的慢病毒载体；S3.使用含hBMP‑2‑GV347慢病毒载体转染BMSCs，得到hBMP‑2‑GV347‑BMSCs；S4.使用含酚基羧甲基纤维素作为微囊材料包裹hBMP‑2‑GV347‑BMS...

【技术特征摘要】
1.一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.设计目的基因hBMP-2引物，PCR扩增、纯化后将目的基因hBMP-2定向克隆至携带Tet-on调控系统的GV347载体上，构建hBMP-2-GV347质粒；S2.将hBMP-2-GV347质粒转化、扩增后，与辅助质粒共感染293T细胞；收集和浓缩慢病毒液，使用慢病毒载体转染293T细胞，得到含hBMP-2-GV347的慢病毒载体；S3.使用含hBMP-2-GV347慢病毒载体转染BMSCs，得到hBMP-2-GV347-BMSCs；S4.使用含酚基羧甲基纤维素作为微囊材料包裹hBMP-2-GV347-BMSCs。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S4中酚基羧甲基纤维素微囊的粒径为80~160μm。3.根据权利要求2所述的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：白波，钱东阳，张姝江，杜秀藩，黄芳立，陈艺，姚咏嫦，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东,44