逆转录病毒载体和慢病毒载体制造技术

本发明专利技术提供具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域，其中所述促有丝分裂或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。当通过此类病毒载体转导细胞例如T细胞或自然杀伤细胞时，它们被促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白同时活化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】逆转录病毒载体和慢病毒载体专利
本专利技术涉及逆转录病毒和慢病毒载体以及用于它们的产生的细胞。所述载体可以用于转导细胞，例如T细胞。特别地，本专利技术涉及能够转导并活化细胞例如T细胞的逆转录病毒或慢病毒载体。专利技术背景生成工程化的T细胞产物通常要求使用促细胞分裂剂(mitogen)刺激随后使用整合载体例如慢病毒载体或逆转录病毒载体转导。广泛使用的方法是向细胞培养物添加可溶的促有丝分裂单克隆抗体(mAb)，例如抗TCR/CD3和抗CD28。替换方法是将抗TCR/CD3mAb连同抗CD28mAb一起附接于珠。相比于单独的可溶性抗体，所述珠的表面具有改进的T细胞活化特性。另外，普遍将细胞因子(例如IL2、IL15或IL17)添加至细胞培养物。这些促有丝分裂剂抗体和细胞因子是单次使用的消耗品，且通常代表了T细胞产生过程中最昂贵的部分。Maurice等人描述了慢病毒包膜蛋白的直接工程化，使得CD3激动剂OKT3展示在病毒粒子表面(Mauriceetal.；Blood；2002；99；2342-2350)。Verhoeyen等人描述了相似的方法，其中慢病毒包膜蛋白经工程化以整合IL7(Verhoeyenetal.；Blood；2003；101；2167-2174)。这些工程化方法中的每一种要求对病毒包膜蛋白的复杂工程化。该复杂工程化必须对待展示在病毒粒子表面上的每种离散的肽执行。所述方法也已经显示降低病毒滴度。因此，对于不与上述缺点相关的用于生成工程化的T细胞产物的新方法存在需要。附图简述图1-由脂质双层包围的retroSTIM载体的图，所述脂质双层散布有RD114包膜糖蛋白和各种促有丝分裂元件如scFv或膜结合的细胞因子。图2-证明OKT3scFv可以整合到慢病毒中。结果显示T细胞的活化(a)未刺激-使用来自294T细胞的慢病毒载体转导；(b)使用OKT3、CD28.2和IL-2刺激-使用来自293T细胞的慢病毒载体转导；(c)未刺激-使用来自293T.OKT3的上清液转导，所述293T.OKT3仅使用转移载体转染；(d)未刺激-使用来自293T.OKT3的慢病毒载体转导。顶部图显示了转导的散点图(x-轴)，和通过CD25表达的活化(y-轴)。底部图显示了T细胞培养物的显微照片。聚集(clumping)指示活化。图3-证明T细胞的促有丝分裂刺激和转导依赖于gagpol。使用gagpol、RD-PROenv，所有三种质粒的转移载体连同rev转染稳定表达表面结合的OKT3的293T细胞。将随后的上清液应用于原代人T细胞。通过流式细胞术使用以下参数研究T细胞：CD25以测量T细胞活化；抗Fc以检测作为具有Fc间隔区的CAR的转基因；ki67以确定周期中的细胞。仅供给gagpol的条件导致显著的促有丝分裂刺激。仅供给所有质粒(连同rev)的条件导致T细胞的促有丝分裂刺激和转导。图4-证明不同的慢病毒假型化(pseudotyping)支持促有丝分裂效果。使用慢病毒转移载体、慢病毒gagpol，rev和不同的env质粒转染稳定表达膜结合的OKT3的293T细胞：即VSV-G、RD-PRO、Ampho、GALV和麻疹(Measles)M/H。将随后的上清液应用于原代人T细胞。所述细胞随后使用ki67染色并通过流式细胞术分析。所有假型支持促有丝分裂效果，尽管使用麻疹假型化似乎降低效果。图5-证明使用gamma-逆转录病毒载体实现了T细胞的促有丝分裂刺激和转导。使用编码CAR、gamma-逆转录病毒gagpol表达质粒和RD114表达质粒的gamma-逆转录病毒转移载体转染稳定表达膜结合的OKT3的293T细胞。将随后的上清液应用于原代人T细胞。所述T细胞随后使用抗Fc、抗CD25和ki67染色并通过流式细胞术研究。尽管没有应用促有丝分裂刺激物，T细胞被活化、循环，并表达转基因。图6-证明可以将两种不同的促有丝分裂刺激物整合到病毒载体中，且与仅抗CD3/TCR相比，抗CD3/TCR刺激物连同抗CD28刺激物具有改进的效果。图7-使用自在其细胞表面表达不同元件的293T细胞生成的不同慢病毒载体刺激的T细胞的低分辨率显微术。图8-使用展示促有丝分裂和细胞因子肽的不同组合的lentiSTIM载体转导后CD4和CD8T细胞的活化。通过转导后120小时的CD25表达确定活化。图9-使用展示促有丝分裂和细胞因子肽的不同组合的lentiSTIM载体转导后CD4和CD8T细胞的增殖。通过转导后120小时的Ki67表达确定增殖。图10-使用展示促有丝分裂和细胞因子肽的不同组合的lentiSTIM载体转导后T细胞的扩增。通过转导后120小时的绝对细胞计数确定扩增。图11-检查使用表达抗CD3和抗CD28抗体的lentiSTIM载体或使用抗CD3和抗CD28抗体包被的珠活化的PBMC的T细胞亚组表型。NM-LV＝未修饰的慢病毒；STIM-LV＝lentiSTIM载体；Tem＝效应记忆T细胞；Tcm＝中央记忆T细胞；Tscm＝干记忆T细胞；和Tn＝幼稚T细胞。专利技术概述本专利技术基于以下发现，即可以将促有丝分裂刺激物和/或细胞因子刺激物整合到逆转录病毒或慢病毒衣壳中，使得病毒既活化又转导T细胞。这去除了添加载体、促细胞分裂剂和细胞因子的需要。本专利技术涉及在生产或包装细胞中包括促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白，其当从生产/包装细胞膜出芽时，整合到逆转录病毒中。所述促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白在生产细胞(producercell)上作为单独的细胞表面分子表达而不是病毒包膜糖蛋白的一部分。这意味着病毒包膜的读码框不受影响，因此保留了功能完整性和病毒滴度。因此，在第一个方面本专利技术提供具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域其中所述促有丝分裂或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。逆转录病毒或慢病毒载体可以包含单独的病毒包膜糖蛋白，其由env基因编码。因此，提供的是具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)病毒包膜糖蛋白；和(ii)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其具有以下结构：M-S-TM其中M是促有丝分裂结构域；S是任选的间隔区且TM是跨膜结构域；和/或(iii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域。所述促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。它们作为病毒包膜中单独的蛋白存在，且由单独的基因编码。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以具有以下结构：M-S-TM其中M是促有丝分裂结构域；S是任选的间隔区且TM是跨膜结构域。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以结合活化T细胞表面抗原例如CD3、CD28、CD134或CD137。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以包含用于此类活化T细胞表面抗原的激动剂。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以包含来自抗体例如OKT3、15E8、TGN1412的结合结构域；或共刺激分子例如OX40L或41BBL。病毒载体可以在病毒包膜中本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域其中所述促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.02 GB 1503500.91.具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域其中所述促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。2.根据权利要求1的病毒载体，其包含结合CD3、CD28、CD134或CD137的促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。3.根据权利要求2的病毒载体，其中所述促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白包含来自OKT3、15E8、TGN1412、OX40L或41BBL的结合结构域。4.根据权利要求1的病毒载体，其在所述病毒包膜中包含两个或更多个促有丝分裂T细胞活化跨膜结构域。5.根据权利要求4的病毒载体，其包含结合CD3的第一促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和结合CD28的第二促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。6.根据前述权利要求任一项的病毒载体，其包含基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，所述基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白包含选自IL2、IL7和IL15的细胞因子。7.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其包含产生假性化病毒载体的异源病毒包膜糖蛋白。8.根据权利要求7的病毒载体，其中所述包膜糖蛋白来自RD114或其变体之一，VSV-G，长臂猿白血病病毒(GALV)，或是双嗜性(Amphotropic)包膜糖蛋白、麻疹(Measles)包膜糖蛋白，或狒狒逆转录病毒包膜糖蛋白。9.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述病毒包膜还包含：(iii)标签化蛋白，所述标签化蛋白包含：结合捕获部分的结合结构域；和跨膜结构域通过所述标签化蛋白对所述捕获部分的结合，所述标签化蛋白促进所述病毒载体从细胞上清液的纯化。10.根据权利要求9的病毒载体，其中所述标签化蛋白的所述结合结构域包含一个或多个链霉亲合素结合表位。11.根据权利要求10的病毒载体，其中所述链霉亲合素结合表位是生物素模拟物。12.根据权利要求11的病毒载体，其中所述生物素模拟物以比生物素低的亲和力结合链霉亲合素，使得生物素可以用于洗脱由包装细胞产生的链霉素捕获的逆转录病毒载体。13.根据权利要求12的病毒载体，其中所述生物素模拟物选自下组：StreptagII(SEQIDNO:36)、Flankedccstretag(SEQIDNO:37)和ccstreptag(SEQIDNO:38)。14.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其包含编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸序列。15.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其是病毒样颗粒(VLP)。16...

【专利技术属性】
技术研发人员：M普莱，L梅卡欧伊，
申请(专利权)人：UCL商务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB