能敲低内源性CTLA4表达的CIK及制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种能敲低内源性CTLA4表达的CIK及其制备方法与应用。本发明专利技术提供了制备能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂的方法，包括：A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；B)向步骤A)所得CIK中转入能敲低内源性CTLA4表达的载体，培养13‑16天后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂；所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有多个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述多个为2‑30个。实验结果表明，该载体可以大大降低CIK细胞中内源CTLA4的表达水平，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。

CIK and its preparation methods and applications that can knock low endogenous CTLA4 expression

The invention discloses a CIK, which can knock low endogenous CTLA4 expression, and its preparation method and application. The present invention provides a method, CIK cell preparation can knockdown the expression of endogenous CTLA4 include: A) to induce the differentiation of PBMC into CIK cells in vitro using factor; B) to step A) into the vector can knockdown the expression of endogenous CTLA4 in the resulting CIK cultured for 13 cells harvested after 16 days, CIK cell preparation and prepare the can knockdown of endogenous CTLA4 expression; the carrier can knockdown the expression of endogenous CTLA4 containing a series of targeted CTLA4 gene encoding miRNA; the plurality of 2 30. The experimental results showed that the vector could greatly reduce the expression level of endogenous CTLA4 in CIK cells, thus significantly improving the tumor killing activity of CIK cells.

【技术实现步骤摘要】
能敲低内源性CTLA4表达的CIK及制备方法与应用
本专利技术属于细胞治疗领域，涉及一种能敲低内源性CTLA4表达的CIK及制备方法与应用。
技术介绍
CIK(Cytokine-InducedKillerCells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有肿瘤杀伤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，临床上已经有大量的病例证实其肿瘤杀伤活性。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4,CTLA-4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。基因重组的CTLA-4IgG可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用。同时，CTL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂的方法，包括如下步骤：(A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；(B)向步骤(A)所得CIK中转入能敲低内源性CTLA4表达的载体，培养后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂；所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有多个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述多个为2‑30个。

【技术特征摘要】
1.一种制备能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂的方法，包括如下步骤：(A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；(B)向步骤(A)所得CIK中转入能敲低内源性CTLA4表达的载体，培养后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性CTLA4表达的CIK细胞制剂；所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有多个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述能敲低内源性CTLA4表达的载体为慢病毒载体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述能敲低内源性CTLA4表达的载体上含有17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因；所述17个串联的靶向CTLA4的miRNA的编码基因分别如下：(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；(4)miRNA-CTLA4-161：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；(5)miRNA-CTLA4-314：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；(6)miRNA-CTLA4-397：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；(7)miRNA-CTLA4-434：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；(8)miRNA-CTLA4-445：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；(9)miRNA-CTLA4-536：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；(10)miRNA-CTLA4-585：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；(11)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；(12)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；(13)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示；(14)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列如序列表中序列1的第4185-4243位或序列2的第4940-4998位所示；(15)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列如序列表中序列1的第4323-4381位或序列2的第5078-5136位所示；(16)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列如序列表中序列1的第4461-4519位或序列2的第5216-5274位所示；(17)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列如序列表中序列1的第4599-4657位或序列2的第5354-5412位所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述能敲低内源性CTLA4表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁绍鹏，占顺利，高磊，
申请(专利权)人：北京瑞健科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11