一种筛选CHO细胞系高表达位点的方法技术
A method for screening high expression sites in CHO cell lines
The invention discloses a method for screening CHO cell lines with high expression locus method, the method will be a green fluorescent gene lentiviral integration into the genome of CHO cell by flow cytometry, fluorescence method has high expression and expanding culture collection of monoclonal cells, and then filter out high expression of the corresponding chromosomal integration site step technique. The method combined with CRISPR/Cas9 mediated fixed-point integration technology can quickly insert the foreign gene expressed accurately on the found site, and can rapidly and efficiently obtain the high expression cell line of foreign protein.
【技术实现步骤摘要】
一种筛选CHO细胞系高表达位点的方法
本专利技术涉及生物基因
，尤其是涉及一种利用带有绿色荧光基因的慢病毒感染CHO细胞，并筛选出高表达位点的方法。
技术介绍
中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvarycell,CHO)作为生物制药领域的主力细胞系，已经被开发出许多不同种类的CHO细胞系，甚至包括那些可以用来扩大基因拷贝数的细胞系；然后，转基因拷贝数的增多并不一定意味着目的蛋白产率得到显著提高；且即使蛋白表达增多，此类表达也常常不稳定。此外，当前普遍使用的构建稳转细胞的方法耗时耗力，这主要是因为需要重复大量的单克隆筛选过程，所以当前在途径工程领域普遍期待可以开发出一种能在短时间内，获得高表达及稳定表达的细胞的方法，并且能够确保如此构建出来的产物与传统方法相比，有相同的质量水平，以确保监管机构的批准。传统构建外源蛋白表达细胞系的方法是通过外源基因随机整合到细胞基因组上，再经过一层层的高表达单克隆细胞筛选，以获得外源蛋白高表达细胞系，由于位点效应的存在，随机整合产生的重组细胞表达水平各异，因此需要后期花费很长的时间用于挑选高表达单克隆细胞；这增加了...
【技术保护点】
一种筛选CHO细胞系高表达位点的方法，其特征在于所述方法将带有绿色荧光基因的慢病毒整合到CHO细胞基因组中，通过流式分选方法将荧光表达量高的单克隆细胞收集并扩培后，再利用染色体移步技术筛选出相应的高表达整合位点。
【技术特征摘要】
1.一种筛选CHO细胞系高表达位点的方法，其特征在于所述方法将带有绿色荧光基因的慢病毒整合到CHO细胞基因组中，通过流式分选方法将荧光表达量高的单克隆细胞收集并扩培后，再利用染色体移步技术筛选出相应的高表达整合位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括如下具体步骤：(1)构建带荧光标签的慢病毒；通过无内毒素质粒提取试剂盒抽提出pLVX-CMV-MCS-T2A-Zsgreen，pSPAX2及pMD2G三种质粒并将其共同转染至HEK-293T细胞，分别于48小时、72小时取两次细胞上清液，收集后的上清液经过超速离心、测滴度获得高滴度的慢病毒；(2)慢病毒感染CHO细胞；将CHO细胞铺在24孔板上，在37℃，5％CO2培养条件下，培养24h，吸去旧培养基，之后将步骤(1)制得的荧光标签的慢病毒用新鲜细胞培养基稀释，加入250μL到孔内，感染细胞，在37℃条件下，感染4小时后补齐另外250μL细胞培养基，24h后更换新鲜培养基，感染120小时经过2次传代后，制得感染慢病毒的CHO细胞；(3)筛选荧光较强细胞，并进行培养；通过高通量的筛选方法即流式细胞分选方法，分选出荧光强度最亮的细胞，并将其直接接种到96孔板内；一周后细胞长成单克隆聚落时，再在荧光显微镜下观察，将最亮的、形态正常且数量正常的细胞系标注并转移到24孔板内扩大培养，细胞长满后再转移到6孔板内培养，最后再扩大至10cm的培养皿中培养，抽提出每个细胞系的基因组DNA；(4)将步骤(3)获得的各个细胞系的基因组DNA利用染色体步移技术筛选慢病毒所有的整合位点，从而找出CHO细胞系高表达位点。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述三种质粒的制备过程为：将三种质粒转化到Tiangen公司大肠杆菌菌株DH5α(CB101-03)...
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