巨细胞病毒抗原及其用途制造技术

本发明专利技术提供了经修饰的巨细胞病毒(CMV) gL蛋白和包含gL蛋白的复合物。所述经修饰的gL蛋白保持完整且能够与其它CMV蛋白形成复合物。

Cytomegalovirus antigen and its use

The invention provides a modified by cytomegalovirus (CMV) and gL protein complexes containing gL protein. The modified gL protein remains intact and can form a complex with other CMV proteins.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】巨细胞病毒抗原及其用途序列表本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子地提交，且特此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本（创建于2016年1月14日）被命名为VN056504WO_SL.txt，且具有26,466字节的大小。
本专利技术属于可以用于疫苗的巨细胞病毒(CMV)抗原的领域。
技术介绍
巨细胞病毒是属于被称作疱疹病毒科（Herpesviridae）或疱疹病毒的病毒科的一个病毒属。感染人类的该物种通常被称作人巨细胞病毒(HCMV)或人疱疹病毒-5(HHV-5)。在疱疹病毒科内，HCMV属于β疱疹病毒亚科，其也包括来自其它哺乳动物的巨细胞病毒。尽管它们在全身各处都有发现，但是HCMV感染经常与唾液腺相关。如抗体在大量一般群体中的存在所指示的，HCMV感染50％至80％之间的美国成年人(全世界的40％)。HCMV感染在健康人中通常是不引人注意的，但对于免疫受损者(诸如HIV感染的人、器官移植接受者或新生婴儿)而言可以是危及生命的。HCMV是最频繁地传播给发育中的胎儿的病毒。感染后，HCMV能够在宿主终生在体内维持潜伏状态，偶尔从潜伏状态再激活。鉴于该疾病的严重程度和重要性，获得有效的疫苗被认为是公共卫生最应优先考虑的事(Sung,H.,等人,(2010)Expertreviewofvaccines9,1303-1314;Schleiss,ExpertOpinTherPat.Apr2010;20(4):597-602)。已经将超过20种不同HCMV毒株的基因组进行了测序，包括实验室毒株和临床分离物的那些。例如，已经对以下HCMV毒株进行了测序：Towne(GL239909366)、AD169(GI:219879600)、Toledo(GL290564358)和Merlin(GI:155573956)。HCMV毒株AD169、Towne和Merlin可以得自美国典型培养物保藏中心(分别是ATCCVR538、ATCCVR977和ATCCVR1590)。巨细胞病毒含有未知数目的膜蛋白复合物。在病毒包膜中的约30种已知糖蛋白中，已经发现gH和gL具有特别的吸引力，因为它们存在于几种不同的复合物中：二聚体gH/gL、三聚体gH/gL/gO(也被称作gCIII复合物)和五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131(pUL131也被称作“pUL131A”、“pUL131a”或“UL131A”；pUL128、pUL130和pUL131亚基，有时也被称作UL128、UL130、UL131)。CMV被认为使用五聚体复合物通过胞吞作用和低pH依赖性的融合进入上皮和内皮细胞，但是其被认为在涉及gH/gL或可能涉及gH/gL/gO的过程中在质膜处通过直接融合进入成纤维细胞。gH/gL和/或gH/gL/gO复合物对于成纤维细胞感染而言是足够的，但是五聚体复合物是感染内皮和上皮细胞所必需的。五聚体复合物被视作CMV疫苗接种的主要靶标。内皮进入需要病毒基因UL128、UL130和UL131(Hahn,JournalofVirology2004;78:10023-33)。适应成纤维细胞的非内皮向性的毒株含有在这三个基因中的至少一个中的突变。例如，Towne毒株含有造成UL130基因中的移码的双碱基对插入，而AD169含有在UL131基因中的单碱基对插入。Towne和AD169都适应在内皮细胞中的生长，且在两种情况下，修复了UL130或UL131基因中的移码突变。US7704510公开了pUL131A是上皮细胞向性所必需的。US7704510还公开了pUL128和pUL130与gH/gL形成整合进病毒粒子中的复合物。该复合物是感染内皮和上皮细胞所必需的，但并非感染成纤维细胞所必需的。已经发现抗-CD46抗体会抑制上皮细胞的HCMV感染。在临床试验中测试的CMV疫苗包括Towne疫苗、Towne-Toledo嵌合体、含有gB作为抗原的α病毒复制子、gB/MF59疫苗、由GlaxoSmithKline生产的gB疫苗、以及使用gB和pp65的DNA疫苗。pp65是为针对CMV的CD8+应答的有效诱导物的病毒蛋白。这些疫苗都是阻断病毒进入内皮/上皮细胞的抗体的差诱导物(Adler,S.P.(2013),BritishMedicalBulletin,107,57-68.doi:10.1093/bmb/ldt023)。在CMV疫苗中的临床前动物研究包括灭活的已经在UL131基因中进行了修复的AD169、使用野生型UL130基因的DNA疫苗和使用来自pUL130和131的肽的肽疫苗(Sauer,A,等人,Vaccine2011;29:2705-1,doi:10.1016)。认为CMVgB抗原是阻断进入内皮/上皮细胞的抗体的差诱导物。在II期临床试验中，gB/MF59疫苗仅50%有效地预防在家陪伴儿童的年轻女性的原发性感染(Pass,RF,等人,NEnglJMed2009;360:1191-9)。因此，需要开发包含其它抗原靶标（诸如gH/gL、gH/gL/gO或五聚体复合物gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131）的CMV疫苗。专利技术概述如本文中公开和举例说明的，本专利技术人发现当从哺乳动物宿主(诸如CHO细胞或HEK细胞)重组地表达和纯化巨细胞病毒抗原gL时，gL的大部分被切掉。为了改善完整gL蛋白的重组表达和纯化，引入突变来减少gL的蛋白酶切割。所述突变体在重组生产过程中表现出增加的对蛋白酶切割的抗性。因此，在一个方面，本专利技术提供了一种重组CMVgL蛋白或其复合物形成片段，其中所述gL蛋白或片段包含在蛋白酶识别位点处的突变，其中所述突变与对照相比减少在所述蛋白酶识别位点处的蛋白酶切割。蛋白酶识别位点表示残基91-102(基于SEQIDNO:1进行编号)。优选地，所述突变与对照相比减少蛋白酶切割，而不改变蛋白酶识别位点的C-端部分的二级结构(认为其具有β-链构象)。本文还提供了包含本文描述的gL蛋白或片段的CMV复合物。这样的复合物可以是gH/gL复合物、gH/gL/gO复合物和五聚体复合物gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131。如本文中所述，本文还提供了编码CMVgL蛋白和其复合物形成片段的核酸。所述核酸可以用作基于核酸的疫苗(例如，编码gL或其复合物形成片段的自主复制RNA分子)。所述核酸还可以用于重组生产gL蛋白或片段、或包含gL蛋白或片段的CMV复合物。本专利技术还提供了包含本文描述的核酸的宿主细胞。所述核酸可以由宿主细胞用于表达gL蛋白或其复合物形成片段、或包含gL或其复合物形成片段的CMV复合物。优选地，所述CMV复合物可以从宿主细胞分泌。优选的宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，诸如CHO细胞或HEK-293细胞。本专利技术还提供了包含本文描述的宿主细胞的细胞培养物。优选地，所述培养物是至少20升大小。当用于表达CMV五聚体复合物gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131时，优选的是，五聚体复合物的收率为至少0.1g/L。本专利技术还提供了诱导针对CMV的免疫应答的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用免疫学上有效量的如本文中所述的gL蛋白、或其复合物形成片段、或包含gL蛋白或片段的CM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组巨细胞病毒gL蛋白或其复合物形成片段，其中所述gL蛋白或片段包含在蛋白酶识别位点处的突变，其中所述突变与对照相比减少在所述蛋白酶识别位点处的蛋白酶切割。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.22 EP 15152221.61.一种重组巨细胞病毒gL蛋白或其复合物形成片段，其中所述gL蛋白或片段包含在蛋白酶识别位点处的突变，其中所述突变与对照相比减少在所述蛋白酶识别位点处的蛋白酶切割。2.根据权利要求1所述的gL蛋白或片段，其中所述突变包含氨基酸残基的添加、缺失、置换或它们的组合。3.根据权利要求1或2所述的gL蛋白或片段，其中所述蛋白酶识别位点的残基形成β-链，且所述突变维持所述β-链构象。4.根据权利要求1-3中的任一项所述的gL蛋白或片段，其中当在哺乳动物宿主细胞中重组地表达时，所述突变导致不超过20%(摩尔百分比)的gL在所述蛋白酶识别位点处被切割。5.根据权利要求1-4中的任一项所述的gL蛋白或片段，其中所述突变包含2-5个氨基酸残基的添加。6.根据权利要求1-5中的任一项所述的gL蛋白或片段，其中所述突变包含1-3个氨基酸残基的缺失。7.根据权利要求1-6中的任一项所述的gL蛋白或片段，其中所述突变包含将残基用来自另一种疱疹病毒的gL蛋白的对应残基置换。8.根据权利要求7所述的gL蛋白或片段，其中来自另一种疱疹病毒的gL蛋白是来自HSV1、HSV2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：A卡菲，C齐费里，邢仪，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE