蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提出了蛋白质前处理方法、蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用。本发明专利技术所提出的蛋白质前处理方法能够充分消除蛋白二级结构的影响，充分暴露蛋白质中氨基酸的结构，进而便于后续对变性酶解后蛋白样品的检测，并且本发明专利技术所提出的方法不会引起蛋白质原氨基酸的结构变化，进而能够有效避免对后续检测的干扰。本发明专利技术所提出的蛋白质脱酰胺化的检测方法，能够特异、灵敏、快速、准确地检测蛋白质的脱酰胺化程度，可作为蛋白质生物药生产的重要的质控检测手段。

Detection method of deacylation of protein and its application

The invention provides a method for pretreatment of protein, a detection method for deacylation of protein and its application. Protein pretreatment method of the present invention can fully eliminate the influence of protein two level structure, fully exposed structure of amino acids in proteins, thus facilitate the subsequent detection of protein sample degeneration after enzymolysis, and the method proposed by the invention does not cause changes in the structure of the original protein amino acid, which can effectively avoid the interference of subsequent detection the. The detection method of protein deamidation is able to detect the degree of deamination of protein in a specific, sensitive, rapid and accurate way, and can be used as an important quality control and detection means for protein biological medicine production.

【技术实现步骤摘要】
蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用，更具体地，本专利技术涉及蛋白质前处理方法、蛋白质脱酰胺化的检测方法以及确定蛋白药物生产工艺的方法。
技术介绍
蛋白质脱酰胺化是蛋白质储存过程中一种常见的降解反应。生物体内脱酰胺化是一种重要的蛋白质翻译后修饰(posttranslationalmodification)，主要在脱酰胺酶的催化作用下完成；脱酰胺化常作为许多生物学过程的分子钟(molecularclock)影响蛋白质的合成和代谢的周期调控、细胞增殖及蛋白折叠等过程。许多蛋白质在生产和储存过程中会发生非酶催化的脱酰胺化，是导致蛋白质活性损失的主要原因之一，常导致蛋白质的局部亲/疏水性发生变化，并在很大程度上影响蛋白质的空间结构、降低生物活性甚至改变其生物学功能；此外，脱酰胺化还可能影响蛋白质的代谢动力学。因此，为控制产品质量，研究药用蛋白质在不同条件下的脱酰胺程度对于筛选合适存储条件、优化制剂配方、分析蛋白结构、减少活性损失具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够特异、灵敏、快速、准确地测定蛋白质脱酰胺化程度的方法。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种蛋白质前处理方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)将所述蛋白质进行第一稀释处理，所述第一稀释处理是在蒸馏水中进行的，第一稀释处理后的蛋白质的浓度为1mg/ml～4mg/ml；(2)将所述第一稀释处理后的蛋白质进行氮吹干处理，任选地，所述氮吹干处理是在氮气的流量为10～15L/min的条件下进行的；(3)将氮吹干处理后的蛋白质进行变性处理，所述变性处理是将所述氮吹干处理后的蛋白质与尿素进行接触实现的；(4)将变性处理后的蛋白质进行二硫键破坏处理，所述二硫键破坏处理是通过将所述变性处理后的蛋白质与DTT进行接触实现的；以及(5)将经过二硫键破坏处理后的蛋白质进行消化处理，以便获得变性酶解后的蛋白质，其中，所述消化处理是通过将所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质与胰酶在37℃的条件下进行1～2h的接触实现的，所述胰酶与所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质的质量比为1:20～1:100。专利技术人经过实验发现，本专利技术所提出的蛋白质前处理方法能够充分消除蛋白二级结构的影响，充分暴露蛋白质中氨基酸的结构，从而便于后续对变性酶解后蛋白样品的检测，并且本专利技术所提出的方法不会引起蛋白质原氨基酸的结构变化，进而能够有效避免对后续检测的干扰。根据本专利技术的实施例，上述蛋白质前处理方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，基于50微升稀释处理后的蛋白质，浓度为8M的所述尿素的用量为20微升，浓度为5mM的所述DTT的用量为2.2微升。专利技术人发现，在上述处理条件下，二硫键被充分打开、蛋白质变性彻底。根据本专利技术的实施例，上述蛋白质前处理方法进一步包括：进行所述消化处理前，预先将所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质进行第二稀释处理，所述第二稀释处理在Tris-HCl中进行的。专利技术人发现，第二稀释处理能够显著降低尿素以及DTT对胰酶活性的干扰，也能够显著降低尿素以及DTT对消化处理的干扰，进而最大限度地保证胰酶对蛋白质的充分消化。根据本专利技术的实施例，基于50微升稀释处理后的蛋白质，浓度为50mM的所述Tris-HCl的用量为60微升。专利技术人经过实验发现，在上述第二稀释倍数下，稀释所带来的降干扰效果更加显著。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种蛋白质脱酰胺化的检测方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)按照前面所述的方法，对待测蛋白质进行前处理，以便获得变性酶解后的蛋白质；(2)将所述变性酶解后的蛋白质进行PIMT酶催化处理，PIMT酶催化处理反应体系为蒸馏水10μl5×反应缓冲液10μl0.1mMSAM溶液10μl0.2mg/mlPIMT10μl变性酶解后的蛋白质10μl所述PIMT酶催化处理是在30℃进行30min；(3)将经过PIMT酶催化处理后的蛋白质进行RP-HPLC色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定待测蛋白质脱酰胺化程度，其中，RP-HPLC色谱分析的条件为：液相色谱仪：Agilent1260或者Waterse2695，检测器/检测波长：260nm，色谱柱：PhenomenexSynergiTM4μHydroRP－80(4μm，150mm×3mm)，流速：1.0ml/min，进样量:40μl,采集时间:15min，柱温：25℃，流动相A：50mMK3PO4(pH6.0～7.0)，流动相B：甲醇，洗脱梯度为时间min％A％B09010570305.59010159010本专利技术所提出的蛋白质脱酰胺化的检测方法，能够特异、灵敏、快速、准确地检测蛋白质的脱酰胺化程度，可作为蛋白质生物药生产的重要的质控检测手段。根据本专利技术的实施例，上述蛋白质脱酰胺化的检测方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括对SAH标准品进行所述RP-HPLC色谱分析，以便确定SAH的量与所述SAH的量对应的峰面积。根据本专利技术的实施例，专利技术人采用SAH标准品连续进样6针，进行RP-HPLC色谱分析，发现连续进样6针的峰面积的RSD≤2.0％，说明SAH的量与其对应的峰面积稳定。根据本专利技术的实施例，所述基于液相色谱分析的结果，确定待测蛋白质脱酰胺化程度是通过如下方式实现的：确定异天冬氨酸的量，所述确定异天冬氨酸的量是通过比较测得的SAH峰面积与SAH标准品的峰面积实现的；将所述异天冬氨酸的量与待测蛋白质的总量相比，并以所得比值表征所述待测蛋白质脱酰胺化程度。根据本专利技术的实施例，在上述确定待测蛋白质脱酰胺化程度的方式下，计算所得的比值能够准确表征待测蛋白质脱酰胺化程度。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种确定蛋白药物生产工艺的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)采用候选工艺，制备蛋白药物；(2)利用前面所述的方法确定所述蛋白药物脱酰胺化程度；以及(3)基于所述蛋白药物的脱酰胺化程度，确定最终蛋白药物生产工艺。利用本专利技术实施例所述提出的确定蛋白药物生产工艺的方法，生产出的蛋白质药物的脱酰化程度能够得到有效的监控和控制，从而产出的蛋白质药物的活性符合临床规定。根据本专利技术的实施例，上述确定蛋白药物生产工艺的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，在步骤(3)中，当所述蛋白药物的脱酰胺化程度低于1.0，则选择所述候选工艺为最终蛋白药物的生产工艺。这是因为，所述蛋白药物的脱酰胺化程度低于1.0，所得蛋白质药物的活性不受影响或影响处于安全水平，则生产该蛋白药物的候选工艺是可以选择的。根据本专利技术的实施例，当所述蛋白药物的脱酰胺化程度不低于1.0，则对所述候选工艺进行优化处理，并重复步骤(1)～(3)直至所述蛋白药物具有生物活性。这是因为，所述蛋白药物的脱酰胺化程度不低于1.0，所得蛋白质药物的活性受到影响或影响处于不安全水平，则生产该蛋白药物的候选工艺需要调整和改进，直到生产出的蛋白药物的脱酰胺程度处于安全水平，才可放行。根据本专利技术的实施例，所述优化处理包括对下列处理至少之一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质前处理方法，其特征在于，包括：(1)将所述蛋白质进行第一稀释处理，所述第一稀释处理是在蒸馏水中进行的，第一稀释处理后的蛋白质的浓度为1mg/ml～4mg/ml；(2)将所述第一稀释处理后的蛋白质进行氮吹干处理，任选地，所述氮吹干处理是在氮气的流量为10～15L/min的条件下进行的；(3)将氮吹干处理后的蛋白质进行变性处理，所述变性处理是将所述氮吹干处理后的蛋白质与尿素进行接触实现的；(4)将变性处理后的蛋白质进行二硫键破坏处理，所述二硫键破坏处理是通过将所述变性处理后的蛋白质与DTT进行接触实现的；以及(5)将经过二硫键破坏处理后的蛋白质进行消化处理，以便获得变性酶解后的蛋白质，其中，所述消化处理是通过将所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质与胰酶在37℃的条件下进行1～2h的接触实现的，所述胰酶与所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质的质量比为1:20～1:100。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质前处理方法，其特征在于，包括：(1)将所述蛋白质进行第一稀释处理，所述第一稀释处理是在蒸馏水中进行的，第一稀释处理后的蛋白质的浓度为1mg/ml～4mg/ml；(2)将所述第一稀释处理后的蛋白质进行氮吹干处理，任选地，所述氮吹干处理是在氮气的流量为10～15L/min的条件下进行的；(3)将氮吹干处理后的蛋白质进行变性处理，所述变性处理是将所述氮吹干处理后的蛋白质与尿素进行接触实现的；(4)将变性处理后的蛋白质进行二硫键破坏处理，所述二硫键破坏处理是通过将所述变性处理后的蛋白质与DTT进行接触实现的；以及(5)将经过二硫键破坏处理后的蛋白质进行消化处理，以便获得变性酶解后的蛋白质，其中，所述消化处理是通过将所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质与胰酶在37℃的条件下进行1～2h的接触实现的，所述胰酶与所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质的质量比为1:20～1:100。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于50微升稀释处理后的蛋白质，浓度为8M的所述尿素的用量为20微升，浓度为5mM的所述DTT的用量为2.2微升。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括：进行所述消化处理前，预先将所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质进行第二稀释处理，所述第二稀释处理在Tris-HCl中进行的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，基于50微升稀释处理后的蛋白质，浓度为50mM的所述Tris-HCl的用量为60微升。5.一种蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，包括：(1)按照权利要求1～4任一项所述的方法，对待测蛋白质进行前处理，以便获得变性酶解后的蛋白质；(2)将所述变性酶解后的蛋白质进行PIMT酶催化处理，PIMT酶催化处理反应体系为蒸馏水10μl5×反应缓冲液10μl0.1mMSAM溶液10μl0.2mg/mlPIMT10μl变性酶解后的蛋白质10μl所述PIMT酶催化处理是在30℃进行30min，(3)将经过PIMT酶催化处理后的蛋白质进...

【专利技术属性】
技术研发人员：周昌茂，王学海，许勇，董思聪，马铮，黄璐，肖强，刘哲，
申请(专利权)人：湖北生物医药产业技术研究院有限公司，武汉珂美立德生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42