一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器及其制备和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，及其制备和检测方法，此方法是基于核酸适体的检测平台，当一个最佳浓度的肺表面活性蛋白A的核酸适配体修饰到到醛基化的玻璃表面,玻片表面微小拓扑变化几乎不会影响传感系统并且仍然保持偏光显微镜下一个黑暗的背景，当肺表面活性蛋白A存在时,肺表面活性蛋白核酸适配体会与肺表面活性蛋白A反应，形成一个类似双链DNA的结构，从而大大改变了玻片表面拓扑结构，此变化可以扰乱液晶的取向,导致偏光显微镜下出现一个由黑暗变化到彩色的液晶光学图像，从而可以检测到肺表面活性蛋白A，这种液晶生物传感器构造非常简单,方便,有很高的灵敏度和很好的选择性，通过使用这种方法,肺表面活性蛋白A的检测限是5 nmol·L

A nucleic acid aptamer liquid crystal biosensor for detection of lung surface active protein A and its preparation and detection methods

The invention discloses a nucleic acid detection of pulmonary surfactant protein A aptamer liquid crystal biosensor and its preparation and detection method, this method is the detection platform based on aptamer, nucleic acid as surfactant protein A an optimum concentration of the aptamer modified to the surface of the glass to the aldehyde, surface small glass will not affect the topology change sensing system and still maintain a dark background under a polarizing microscope, in the presence of surfactant protein A, surfactant protein and nucleic acid adaptation of pulmonary surfactant protein A reaction to form a similar double stranded DNA structure, thereby greatly changing the topology of slide surface this change can disrupt the structure and orientation of liquid crystal, caused by the emergence of a polarizing microscope under dark change to liquid crystal optical color image, which can detect lung surface active egg White A, the liquid crystal biosensor structure is very simple, convenient and has high sensitivity and good selectivity, by using this method, the detection limit of the pulmonary surfactant protein A is 5 nmol - L

【技术实现步骤摘要】
一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器及其制备和检测方法
本专利技术涉及检测
，具体涉及一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，以及该液晶生物传感器的制备方法与检测方法。
技术介绍
肺表面蛋白A(PulmonarySurfactantProteinA，SP-A)，是一种多功能糖蛋白，它在调节肺表面活性物质(PS)代谢、基因表达、肺部免疫和炎症反应中起着重要的作用。SP-A主要形成于Ⅱ型肺泡上皮细胞，肺外少量表达，在肺内的高表达。肺表面活性蛋白A的高或低表达水平和一些临床肺部疾病直接相关，与此同时它也是一些特定的肺部疾病诊断和预后的指标。许多肺部疾病在早期很难根据早期临床表现，X射线检查和一些创伤性迹象检查来评估肺泡毛细血管屏障的损伤程度。最近，许多实验表明，SP-A血清水平的敏感和可靠指标能够反映肺功能障碍和血气屏障的损害。疾病导致肺损伤时，SP-A通过破坏的肺泡毛细血管膜屏障进入血液循环，成为肺损伤的血清标志物。血清SP-A与肺损伤的程度密切相关。SP-A在血清的浓度越高，肺损伤程度越重。血液循环SP-A水平的检测可以判断患者肺损伤程度,预测疾病的结果。目前，SP-A主要的检测方法是放射免疫分析（RIA）测定的方法，酶联免疫吸附(ELISA)，化学发光法和单个或多个斑点免疫印迹方法，这些方法存在制备周期过长，抗体高成本，容易失活等缺点。液晶（Liquidcrystal,LC）兼有液体的流动性及固体的光、电、磁等各向异性等特点。处于向列型液晶态的液晶分子具有长程取向序而无位置序，这一独特的分子排列方式导致表面微小的地貌或化学结构变化即可引起取向变化，同时此取向变化能传播至数十微米的液晶体中，因此液晶具有很强的光学信号放大作用。液晶生物传感器的检测原理是建立在液晶具有双折射特性基础上，根据传感界面接触目标物前后，液晶分子在基底表面的取向排列发生变化，改变对光线的折射能力，导致光学图像信号的颜色和亮度发生变化，实现对目标分子的检测。由于液晶传感器具有响应快、无需标记、无需复杂和昂贵的读取装置和可肉眼直接检测等优点，同时利用核酸适配体的液晶传感器用于肺表面活性蛋白A的检测尚鲜见报道。核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到的一段单链DNA或RNA分子，可以特异性结合目标分子。由于具有选择性高、易合成、易修饰和相对稳定的优点，目前在检测蛋白质、金属离子、有机小分子等领域中应用广泛。本专利技术首次将基于核酸适配体的液晶生物传感器用于检测肺表面活性蛋白A。与此同时,我们也建立一个新型敏感的核酸适配体液晶生物分子分析的平台。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述的液晶生物传感器含有肺表面活性蛋白A核酸适配体。该液晶生物传感器含有肺表面活性蛋白A核酸适配体，该液晶生物传感器具有低成本、操作简单、可肉眼观测、灵敏度高等优点，可以快速的结合目标分子，达到快速准确检测SP-A的目的。一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述肺表面活性蛋白A核酸适配体的序列为5'-NH2-(CH2)6-TGTACGCCTACTGTGTGT-3'，且在5'端修饰了氨基。本专利技术的第二目的是提供一种核酸适配体液晶传感器的制备方法和检测方法。本专利技术所述的检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器的制备方法和检测方法，包括以下步骤：步骤一：玻片的清洗与处理玻片处理用以去除玻璃表面的灰尘和有机物，同时使表面羟基化,将载玻片切割成尺寸为2cm×2cm后放入大烧杯中，往烧杯中倒入浓H2SO4，再倒入双氧水溶液，其中浓H2SO4和双氧水体积比为7:3，将烧杯置于80℃水浴锅中温育1小时，取出后用无水乙醇和去离子水依次清洗5至6次，氮气吹干置于110℃烘箱中干燥2-3小时，防尘保存；步骤二：传感器基底的组装：上玻片：上玻片用N,N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基硅烷(简称DMOAP)水溶液组装将处理的玻片浸入含体积比为0.35%DMOAP的水溶液中，常温下静置反应30min，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时。下玻片：下玻片用N,N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基硅烷(简称DMOAP)和氨丙基三乙氧基硅烷(简称APTES)混合溶液组装将处理的玻片浸入含体积比为3%APTES和体积比为0.3%DMOAP的无水乙醇溶液中，80℃水浴加热2小时，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时，备用。下玻片进行戊二醛（简称GA）组装将用DMOAP和APTES修饰后的下玻片浸入体积分数为2%的GA水溶液中常温下浸泡1h，使玻片表面醛基化，取出用大量去离子水冲洗，氮气吹干，作为下玻片防尘备用。步骤三：清洗溶液的制备和核酸适配体缓冲溶液的制备核酸适配体缓冲溶液的制备：配制含有10mmol·L-1的NaCl和10mmol·L-1的MgCl2的pH=7.4的Tris-HCl溶液作为用于稀释核酸适配体的缓冲溶液。清洗溶液的制备：配制含有体积比为0.01%SDS的2×SSC溶液，用NaOH定容至pH=7.0。步骤四：肺表面活性蛋白A核酸适配体的固定将200μL的100nml·L-1的核酸适配体（Aptamer）溶液滴加到步骤二中的下玻片上，37℃反应2h，用含有步骤三中的清洗溶液和超纯水冲洗，去除多余的核酸适配体分子，然后用氮气吹干。然后再用80mmol·L-1的甘氨酸溶液室温（25度左右）下封闭玻片上未反应的醛基1h，用超纯水冲洗，氮气吹干，以去除传感器的非特异性干扰。步骤五：基于核酸适配体的液晶传感器的制作首先用移液枪吸取200μL不同梯度浓度的SP-A溶液（由0.01mol·L-1的PBS溶液配制）滴到载玻片上与步骤四中已经修饰在玻片上的肺表面活性蛋白A的核酸适配体在室温下反应1h,然后分别用pH=7的0.01mol·L-1的PBS溶液和大量的超纯水冲洗,小流量氮气吹干。随后,液晶5CB被加热到各向同性的液态（约40℃），然后装配进步骤二中由DMOAP修饰的上玻片和SP-A修饰的下玻片，中间放置用于控制液晶厚度的干净的铜载网（20μm，150目）于液晶盒中,液晶充满整个铜载网，液晶盒冷却至室温（约28℃），然后用三个小长尾夹夹在一起制成液晶盒。步骤六：样品检测将步骤五中检测样品的液晶盒置于偏光显微镜(XP-201POL,上海长方，中国)下，通过安装在显微镜筒上的数码相机获取图像(佳能A640，日本)。液晶盒图见说明书附图1和说明书附图2。本专利技术的检测原理是，检测方法的原理图见说明书附图3。在预处理后的玻片上固定DMOAP/APTES/GA，DMOAP是长链状富含烷基的分子，能有效诱导液晶垂直排列，GA活化APTES，提供醛基以固定核酸适配体，作为下玻片（见说明书附图3A）。下玻片与DMOAP组装的上玻片制作成液晶盒，注入液晶，液晶在DMOAP和核酸适配体的诱导下垂直有序排列（见说明书附图3F），此时利用偏光显微镜观察不到任何光透过，偏光显微镜下呈现均一的黑色（见说明书附图3G）。肺表面活性蛋白A能与其核酸适配体（Aptamer）形成类似双链DNA的结构（见说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述的液晶生物传感器含有肺表面活性蛋白A核酸适配体。

【技术特征摘要】
1.一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述的液晶生物传感器含有肺表面活性蛋白A核酸适配体。2.根据权利要求1所述的检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器，其特征在于所述肺表面活性蛋白A核酸适配体的序列为5'-NH2-(CH2)6-TGTACGCCTACTGTGTGT-3'，且在5'端修饰了氨基。3.一种检测肺表面活性蛋白A的核酸适配体液晶生物传感器的制备及检测方法，其特征在于，包括以下步骤，步骤一：玻片的清洗与处理玻片处理用以去除玻璃表面的灰尘和有机物，同时使表面羟基化,将载玻片切割成尺寸为2cm×2cm后放入大烧杯中，往烧杯中倒入浓H2SO4，再倒入双氧水溶液，其中浓H2SO4和双氧水体积比为7:3，将烧杯置于80℃水浴锅中温育1小时，取出后用无水乙醇和去离子水依次清洗5至6次，氮气吹干置于110℃烘箱中干燥2-3小时，防尘保存；步骤二：传感器基底的组装上玻片：上玻片用DMOAP水溶液组装将处理的玻片浸入含体积比为0.35%DMOAP的水溶液中，常温下静置反应30min，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时；下玻片：下玻片用DMOAP和APTES混合溶液组装将处理的玻片浸入含体积比为3%APTES和体积比为0.3%DMOAP的无水乙醇溶液中，80℃水浴加热2小时，用大量超纯水冲洗，氮气吹干，于110℃烘箱干燥1小时，备用；下玻片进行GA组装将用DMOAP和APTES修饰后的下玻片浸入体积分数为2%的GA水溶液中常温下浸泡1h，使玻片表面醛基化，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，王兵，李业芹，邓世雄，熊兴良，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37