一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺制造技术

一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，包括：将鲜活蜈蚣成虫用液氮冷冻后研磨成粉末，加入硫酸铵水溶液和蛋白酶K水溶液处理5～15分钟；然后置于沸水中煮2～8分钟，再置于冰上冷却，摇匀后再离心取上清液；向上清液中加入无水乙醇，混匀后再离心取上层蛋白液；向所述上层蛋白液中加入0.1～0.5倍体积的质量分数为10～30%的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，收集上层溶液；第五步：对所述上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。本发明专利技术的工艺能够快速、高效的提取蜈蚣中的抗凝血肽。

Extraction and purification of anticoagulant peptide from centipede

The extraction and purification process, a centipede anticoagulant peptide including: the fresh adult centipede frozen in liquid nitrogen after grinding into powder, adding ammonium sulfate aqueous solution and K aqueous solution of protease treatment for 5 to 15 minutes; and then placed in boiling water for 2 to 8 minutes, and then placed in ice cooled, shake after centrifugation supernatant adding ethanol to the supernatant; mixing, centrifugation after taking the protein solution; to the upper protein liquid adding 0.1 mass fraction of 0.5 times the volume of 10 ~ 30% sodium sulfate solution, mixed evenly and then adding 1 ~ 2 times the volume of ethanol, mixed evenly and then 12000 ~ 14000r/min centrifugal 15 ~ 25min, collecting the solution; the fifth step: on the upper solution of freeze drying, and made into freeze-dried powder. The process of the invention can quickly and efficiently extract anticoagulant peptide in centipede.

【技术实现步骤摘要】
一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺
本专利技术涉及一种活性成分的提取和纯化工艺，特别涉及一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，属于药物原料深加工

技术介绍
蜈蚣又名天龙、千年虫，为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物，药用始载于《神农本草经》，已有两千多年的药用历史；《本草纲目》载之于虫部第四十二卷，为传统的动物中药材；现代已被纳入《中华人民共和国药典》。其干燥虫体性辛，味温，有毒，归肝经，具息风止痉、解毒散结、通络止痛之功，中医学认为“其走窜之力最速，内而脏腑外而经络，凡气血凝聚之处皆能开之”。临床常用于治疗小儿惊风、疮疡、肿毒、烫伤、风癣等。近代医学中，应用蜈蚣治疗结核病、百日咳、癫痫等，特别是在抗肿瘤、治疗肝炎、神经性头痛、糖尿病并发症及各种肿节等方面均取得良好的疗效，引起了人们从诸多方面对其进行了深入的研究。目前药用蜈蚣多指少棘蜈蚣、多棘蜈蚣和墨江蜈蚣三种，主产于湖北、湖南、江苏、安徽、浙江等省。蜈蚣的赤足因产地不同而异，为同一物种不同种群之间的差异问题，浙江的少棘蜈蚣“赤足”者居多，而湖北的少棘蜈蚣多为“黄足”。由于蜈蚣药材应用广泛，各地药用蜈蚣资源也得到很好的开发，药用蜈蚣的种类扩展到少棘蜈蚣、多棘蜈蚣、墨江蜈蚣、哈氏蜈蚣、日本棘蜈蚣，均同为蜈蚣属，互为不同的亚种。蜈蚣毒素存在于蜈蚣活体中，且含量极少，药用蜈蚣则为经加工的干燥全虫，基本不含蜈蚣毒素，但是文献记载蜈蚣有小毒，因此有研究者对蜈蚣毒和蜈蚣干燥全虫进行对比研究，结果发现两者无论在组成还是药理作用上都有一定的区别，与活体蜈蚣相比，蜈蚣干燥药材的溶血活性大大降低，且随着药材贮存时间的延长，活性越低。另外，研究者还发现在对血小板聚集的促进作用上，两者也有很大的差异，蜈蚣通络活血的作用可能与其毒液中的蛋白酶、溶血因子及其他血液系统活化因子密切相关。现有技术中提取蜈蚣毒素中药用成分的方法有酶解法、水提醇沉法、醇提醇沉法、水浸提法等，但是均存在提取的活性成分有效率不高。
技术实现思路
本专利技术的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种提取效率高，适用于不同地域蜈蚣抗凝血肽的提取、纯化方法，本专利技术提供了一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，包括下列步骤：第一步：将鲜活蜈蚣成虫用液氮冷冻10～30分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入一离心管中，加入质量分数为12％～28％的硫酸铵水溶液和0.01～0.05倍体积的蛋白酶K水溶液，55～58℃条件下处理5～15分钟；第二步：将所述离心管置于沸水中煮2～8分钟，然后置于冰上冷却，摇匀后再3000～5000r/min离心5～10min，取上清液；第三步：向所述上清液中加入1～2倍体积的无水乙醇，混匀后再12000～14000r/min离心15～25min，取上层蛋白液；第四步：向所述上层蛋白液中加入0.1～0.5倍体积的质量分数为10～30％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，收集上层溶液；第五步：对所述上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。优选的技术方案为：包括下列步骤：第一步：将鲜活蜈蚣成虫用液氮冷冻20分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入一离心管中，加入质量分数为25％的硫酸铵水溶液和0.03倍体积的蛋白酶K水溶液，56℃条件下处理12分钟；第二步：将所述离心管置于沸水中煮6分钟，然后置于冰上冷却，摇匀后再4000r/min离心8min，取上清液；第三步：向所述上清液中加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀后再13000r/min离心15～20min，取上层蛋白液；第四步：向所述上层蛋白液中加入0.3倍体积的质量分数为23％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再13000r/min离心20min，收集上层溶液；第五步：对所述上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有的优点是：1、本专利技术的工艺能够快速、高效的提取蜈蚣中的抗凝血肽。2、采用本专利技术所述工艺提取的抗凝血肽在作为抗凝药使用时，具有凝血时间长，抗凝效果强的优点。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。实施例1：一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，所述工艺包含以下步骤：(1)取蜈蚣鲜活成虫，迅速置于液氮罐中，冷冻10分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入离心管中，加入质量分数为12％的硫酸铵水溶液，0.01倍体积的蛋白酶K水溶液，55℃处理5分钟；硫酸铵水溶液的添加量为离心管长度的三分之二。蛋白酶K水溶液的浓度为50～100微克/毫升，在本实施例中为50微克/毫升。(2)取步骤(1)处理后的产物，将离心管迅速置于沸水中煮2分钟，然后置于冰上冷却，上下摇匀后3000r/min离心5min，取上清液；(3)向步骤(2)获得的上清液中加入1倍体积的无水乙醇，上下混匀后在12000r/min离心15min，取上层蛋白液；(4)向步骤(3)收集的上层蛋白液中加入0.1倍体积的质量分数为10％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1倍体积的无水乙醇，混合均匀后12000r/min离心15min，收集上层溶液；(5)将步骤(4)收集的上层溶液冷冻干燥，制成冻干粉，并在-20℃保存。实施例2：一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，所述工艺包含以下步骤：(1)取蜈蚣鲜活成虫，迅速置于液氮罐中，冷冻20分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入离心管中，加入质量分数为25％的硫酸铵水溶液，0.03倍体积的蛋白酶K水溶液，56℃处理12分钟；硫酸铵水溶液的添加量为离心管长度的三分之二。蛋白酶K水溶液的浓度为50～100微克/毫升，在本实施例中为60微克/毫升。(2)取步骤(1)处理后的产物，将离心管迅速置于沸水中煮6分钟，然后置于冰上冷却，上下摇匀后4000r/min离心8min，取上清液；(3)向步骤(2)获得的上清液中加入1.5倍体积的无水乙醇，上下混匀后在13000r/min离心20min，取上层蛋白液；(4)向步骤(3)收集的上层蛋白液中加入0.3倍体积的质量分数为23％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀后13000r/min离心20min，收集上层溶液；(5)将步骤(4)收集的上层溶液冷冻干燥，制成冻干粉，并在-15℃保存。实施例3：一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，所述工艺包含以下步骤：(1)取蜈蚣鲜活成虫，迅速置于液氮罐中，冷冻25分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入离心管中，加入质量分数为22％的硫酸铵水溶液，0.03倍体积的蛋白酶K水溶液，57℃处理12分钟；硫酸铵水溶液的添加量为离心管长度的三分之二。蛋白酶K水溶液的浓度为50～100微克/毫升，在本实施例中为100微克/毫升。(2)取步骤(1)处理后的产物，将离心管迅速置于沸水中煮6分钟，然后置于冰上冷却，上下摇匀后4000r/min离心5min，取上清液；(3)向步骤(2)获得的上清液中加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，其特征在于：包括下列步骤：第一步：将鲜活蜈蚣成虫用液氮冷冻10～30分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入一离心管中，加入质量分数为12%～28%的硫酸铵水溶液和0.01～0.05倍体积的蛋白酶K水溶液，55～58℃条件下处理5～15分钟；第二步：将所述离心管置于沸水中煮2～8分钟，然后置于冰上冷却，摇匀后再3000～5000r/min离心5～10min，取上清液；第三步：向所述上清液中加入1～2倍体积的无水乙醇，混匀后再12000～14000r/min离心15～25min，取上层蛋白液；第四步：向所述上层蛋白液中加入0.1～0.5倍体积的质量分数为10～30%的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，收集上层溶液；第五步：对所述上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。

【技术特征摘要】
1.一种蜈蚣抗凝血肽的提取和纯化工艺，其特征在于：包括下列步骤：第一步：将鲜活蜈蚣成虫用液氮冷冻10～30分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入一离心管中，加入质量分数为12%～28%的硫酸铵水溶液和0.01～0.05倍体积的蛋白酶K水溶液，55～58℃条件下处理5～15分钟；第二步：将所述离心管置于沸水中煮2～8分钟，然后置于冰上冷却，摇匀后再3000～5000r/min离心5～10min，取上清液；第三步：向所述上清液中加入1～2倍体积的无水乙醇，混匀后再12000～14000r/min离心15～25min，取上层蛋白液；第四步：向所述上层蛋白液中加入0.1～0.5倍体积的质量分数为10～30%的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，收集上层溶液；第五...

【专利技术属性】
技术研发人员：史月龙，曾宋君，吴英亮，刘文斌，吴坤林，汤静，
申请(专利权)人：南京仙草堂生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32