一种新的嗜热普鲁兰酶、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于普鲁兰酶制备技术领域，具体涉及一种新的嗜热普鲁兰酶、制备方法及其应用专利申请事宜。通过克隆特定嗜热菌

【技术实现步骤摘要】
一种新的嗜热普鲁兰酶、制备方法及其应用
本专利技术属于普鲁兰酶制备
，具体涉及一种新的嗜热普鲁兰酶、制备方法及其应用专利申请事宜。
技术介绍
淀粉是地球上丰富的生物质资源，它广泛存在于植物的种子、块根、块茎中。淀粉除了直接作为食品原料外，还可通过化学或生物的方法生成其他有价值的物质，包括：氨基酸、葡萄糖浆、有机酸、酒精等。天然淀粉由直链淀粉（amylose）和支链淀粉（amylopectin）组成，其中，直链淀粉是由250-300个D-葡萄糖分子以α-1,4-糖苷键连接而成的多糖，其含量约占淀粉总量的15%-25%；而支链淀粉是高度分支的结构，由24-30个葡萄糖残基以α-1,4-糖苷键首尾相连而成，大约每20个葡萄糖分子就有一个分支，在分支处由α-1,6-糖苷键连接，其中α-1,6-糖苷键的含量约占5%，而支链淀粉的含量约占淀粉总量的75%-85%。然而大多数的淀粉水解酶（如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等）对α-1,6-糖苷键均不起作用，α-淀粉酶和糖化酶联合使用也不能使淀粉的完全分解，因此α-1,6-糖苷键的水解效率直接影响到淀粉的利用率。普鲁兰酶是一种重要的淀粉脱支酶，可以专一性切下支链淀粉的整个支链，从而形成直链淀粉，因此普鲁兰酶在淀粉加工工业中具有十分重要的作用。根据普鲁兰酶作用的底物特异性，可将普鲁兰酶分为两类：I型普鲁兰酶（EC.3.2.1.41）可以专一性水解普鲁兰糖和支链淀粉中的α-1,6-糖苷键，生产麦芽三糖（maltotriose）和直链淀粉；Ⅱ型普鲁兰酶（EC.3.2.1.1/41），又称淀粉普鲁兰酶,不仅可以水解普鲁兰糖和支链淀粉中的α-1,6-糖苷键，同时也可水解其中的α-1,4-糖苷键。普鲁兰酶在工业上的应用非常广泛，但是大部分普鲁兰酶的热稳定性和比酶活不高，或者是不能适应酸性高温的作用环境，而我国对普鲁兰酶的研究始于20世纪70年代，起步比较晚。但是目前国内市场对普鲁兰酶的需求量大，主要依赖进口，价格昂贵。这在一定程度上限制了国内相关行业的发展。因此，开发具有自主知识产权的普鲁兰酶就显得尤为重要了。
技术实现思路
本申请目的在于提供一个利用特定菌株的嗜热普鲁兰酶基因通过异源表达后所制备的耐热普鲁兰酶，该酶具有较好的热稳定性、催化效率和对普鲁兰糖底物较高的亲合力，在淀粉酶解过程中具有一定的应用前景。本申请所采取的技术方案详述如下。嗜热普鲁兰酶的制备方法，通过克隆特定嗜热菌株的普鲁兰酶基因，进而利用载体转化异源菌株构建重组表达菌株，最终异源诱导表达获得嗜热普鲁兰酶，具体包括如下步骤：（1）克隆嗜热菌株的普鲁兰酶基因；以德国菌株保藏中心DSMZ保藏的编号为DSM12029的嗜热菌Thermosiphomelanesiensis为基础，提取其基因组，以此为模板，设计引物，PCR扩增获得普鲁兰酶基因TM-pulA，PCR扩增时，引物序列具体设计如下：上游引物FTM：5′-CTAGCTAGCATGAAAAGATTGTTAGTGTTTTTCTTTGTTTTGTTATC-3′，5’端GCTAGC部分序列为NheI酶切位点；下游引物RTM：5′-TCCGCTCGAGTTTGTTCTTGTAAAAAACATATGCAGAAATTCCTTC-3′，5’端CTCGAG部分序列为XhoI酶切位点；对PCR扩增产物进行电泳检测、并纯化获得普鲁兰酶基因TM-pulA后，4℃保存备用；克隆所得普鲁兰酶基因TM-pulA进一步测序分析后，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；（2）双酶切，并连接构建获得TM-pulA-pET21a表达载体；对步骤（1）中纯化后普鲁兰酶基因TM-pulA进行NheI和XhoI双酶切，并回收酶切产物；同时对pET21a质粒进行NheI和XhoI双酶切，并回收酶切产物；利用T4连接酶（T4DNAligase）对所回收的普鲁兰酶基因TM-pulA和pET21a质粒的酶切产物进行连接，构建获得TM-pulA-pET21a表达载体；（3）热激转化并筛选鉴定；将步骤（2）中的连接产物（所构建TM-pulA-pET21a表达载体）用热激法转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，将转化复苏后感受态细胞涂布在含有氯霉素的抗性LB平板上（氯霉素浓度终浓度0.034μg/mL），培养12~16h以进行抗性筛选；挑选抗性LB平板上的阳性单克隆菌落，进行电泳检测验证，并最终提取质粒进行测序验证，以确保转化及重组正确；（4）诱导表达并制取酶液；对步骤（3）中鉴定正确的重组阳性克隆接种到含有氯霉素的抗性LB培养基中（氯霉素浓度是0.034μg/mL），培养至OD600约为0.6时加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，30℃、220r/min培养6h左右以进行诱导表达，诱导表达结束后，取菌液，离心收集菌体，蒸馏水重悬后进行超声破碎，破碎后离心收集上清液即为粗酶液，进一步地，可对粗酶液进行Co2+螯合琼脂糖凝胶电泳以纯化获得纯普鲁兰酶。利用所述嗜热普鲁兰酶制备方法所制备嗜热普鲁兰酶。所述嗜热普鲁兰酶在淀粉酶解中的应用，具体应用时，适宜pH5.6~6.0，最适pH5.8；适宜温度为75℃~85℃，最适温度为80℃。就普鲁兰酶制备及改进而言，现有技术中主要的及常规做法均是从自然界中筛选产普鲁兰酶产生菌，进而对出版筛选所获菌株进行进一步筛选或培养体系优化。但是这种筛选方式具有很大的盲目性和随机性，而且筛选获得具有较好热稳定性和较好活性普鲁兰酶产酶菌株可能性较低，而且所制备获得普鲁兰酶往往无法适应实际生产中特定温度和pH需求，进而限制了相关生产技术的改进。随着基因工程技术进步，利用生物信息学方法对相关基因进行初步预筛，可大幅降低相关菌株筛选工作的盲目性和筛选周期。本专利技术即是在此思路上，从数据库KEGG和NCBI中筛选确定了嗜热菌Thermosiphomelanesiensis（DSM12029）。对嗜热菌Thermosiphomelanesiensis（DSM12029）的普鲁兰酶基因进行克隆并异源表达后，初步酶学性质分析表明，所制备嗜热普鲁兰酶的适宜pH5.6~6.0，适宜温度为75℃~85℃，具有较高的热稳定性、催化效率以及对普鲁兰糖底物的较高亲和能力，具有一定的生产应用价值，而较好的应用效果也为其他菌株筛选及生物酶制备提供了较好地借鉴参考。附图说明图1为普鲁兰酶基因TM-pulA和二步PCR产物的电泳图，其中M是λ-HindⅢmarker，1、是TM-pulA基因的PCR产物，2是pET21a质粒，3是TM-pulA经NheI和XhoI双酶切；4是pET21a质粒经NheI和XhoI双酶切；图2为重组质粒TM-pulA-pET21a的电泳图，其中M是λ-HindⅢmarker，1是TM-pulA-pET21a重组质粒；图3为纯酶TM-pulA的SDS-PAGE检测图，其中M是proteinmarker，1、2、3中箭头所指是纯酶TM-pulA；图4为TM-pulA的最适pH测定图；图5为TM-pulA的最适温度测定图；图6为TM-pulA半衰期测定图；图7为TM-pulA的酶促动力学参数的测定图(普鲁兰糖作为底物)。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步解释说明。在介绍具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新的嗜热普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）克隆嗜热菌株的普鲁兰酶基因；以德国菌株保藏中心 DSMZ保藏的编号为DSM12029的嗜热菌

【技术特征摘要】
1.一种新的嗜热普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）克隆嗜热菌株的普鲁兰酶基因；以德国菌株保藏中心DSMZ保藏的编号为DSM12029的嗜热菌Thermosiphomelanesiensis为基础，提取其基因组，以此为模板，设计引物，PCR扩增获得普鲁兰酶基因TM-pulA，PCR扩增时，引物序列具体设计如下：上游引物FTM：5′-CTAGCTAGCATGAAAAGATTGTTAGTGTTTTTCTTTGTTTTGTTATC-3′；下游引物RTM：5′-TCCGCTCGAGTTTGTTCTTGTAAAAAACATATGCAGAAATTCCTTC-3′；对PCR扩增产物进行电泳检测、并纯化获得普鲁兰酶基因TM-pulA后，4℃保存备用；（2）双酶切，并连接构建获得TM-pulA-pET21a表达载体；对步骤（1）中纯化后普鲁兰酶基因TM-pulA进行NheI和XhoI双酶切，并回收酶切产物；同时对pET21a质粒进行NheI和XhoI双酶切，并回收酶切产物；利用T4连接酶对所回收的普鲁兰酶基因TM-pulA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明道，聂慧慧，邢岩，王红阳，张雨杭，邱爽，王旭，焦国宝，刘红记，孙利鹏，邱立友，原增艳，付香斌，
申请(专利权)人：河南仰韶生化工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41