一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA及其基因和应用。碱性耐盐普鲁兰酶PulA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及编码上述普鲁兰酶的基因组编码基因

【技术实现步骤摘要】
一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA及其基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA及其基因和应用。
技术介绍
淀粉是由α-D葡萄糖单体通过α-1，4-糖苷键或α-1，6-糖苷键聚合而成的高分子化合物。动植物中存在着大量的淀粉。各类植物中含有较高比例的淀粉，淀粉是植物体储存营养物质的一种方式，植物中的淀粉是以球状颗粒的形式贮藏，分布于种子、根、块茎等。淀粉酶(amylase)是指能水解淀粉和糖原的一类酶的总称。淀粉酶作为一种催化剂，已经被广泛地应用于各个工业领域。大部分的植物、动物、微生物中都含有淀粉酶。根据淀粉酶水解底物产生的糖异构体类型的不同而将其分为α和β淀粉酶。根据淀粉酶的最适反应温度和热稳定性的不同，可将其可分为：高温淀粉酶、中温淀粉酶和低温淀粉酶。根据淀粉酶的最适pH和pH稳定性的不同可将其分为：酸性、中性和碱性淀粉酶。根据淀粉酶水解糖苷键的方式的不同，可将其主要分为：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶等。普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶，能够专一性水解糖原和支链淀粉分支点中的α-1，6-糖苷键，切下支链淀粉的整个侧链将其变成直链淀粉。普鲁兰酶与异淀粉酶有所不同，普鲁兰酶能够水解由两到三个葡萄糖残基构成的侧链而异淀粉酶却不能。按水解位点的不同，普鲁兰酶可分为两种类型，一种是Ⅰ型普鲁兰酶，专一性水解α-1，6-糖苷键；另一种是Ⅱ型普鲁兰酶，也被称为淀粉普鲁兰酶，其同时具有水解α-1，6-糖苷键和内切低聚糖α-1，4-糖苷键的能力。普鲁兰酶作为一种重要的糖苷水解酶，在淀粉加工、葡萄糖浆生产、啤酒生产和医药化工等方面具有巨大的应用价值。目前已报导的产普鲁兰酶的微生物很多，其中大部为细菌，如芽胞杆菌、微小杆菌和嗜冷希瓦氏菌属等。此外，还有部分普鲁兰酶从嗜热古菌和真菌中被发现。因为淀粉的糖化过程需要在较高的温度(55～60℃)、微酸性条件下(pH4.5～5.5)进行，酸性普鲁兰酶在糖浆工业中可提高利用率、降低粮耗和提高产品质量，从而目前报道较多的普鲁兰酶大都是酸性酶。碱性普鲁兰酶在洗涤剂工业中具有重要的应用前景。然而目前对于碱性普鲁兰酶的研究报导很少。此外，关于碱性普鲁兰酶的专利也鲜有报导。本专利技术从大布苏盐碱湖底泥中分离了一株能够产碱性耐盐普鲁兰酶的嗜盐嗜碱菌Alkalibacteriumsp.，利用分子生物学和基因工程的方法获得了该碱性耐盐普鲁兰酶的编码基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有在碱性条件下高活性和高稳定性的特点。此外，该酶具有很好的盐耐受性和稳定性，在4MNaCl存在的情况下还剩余45%以上的酶活。此外，该酶对普鲁兰糖的水解产物为三糖，表明该酶为I型普鲁兰酶。因此，该普鲁兰酶所具有的碱性耐盐的特点，在洗涤剂和食品工业领域具有很大的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA及其基因和应用。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本专利技术的另一目的是提供一种制备上述碱性耐盐普鲁兰酶的基因工程方法。本专利技术的另一目的提供上述碱性耐盐普鲁兰酶的应用。本专利技术首先获得一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA，在碱性及高盐条件下具有很高的酶活。这些性质符合洗涤工业中对普鲁兰酶的碱性的要求，增强去污能力。本专利技术所述碱性耐盐普鲁兰酶PulA，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的普鲁兰酶PulA总共含1184个氨基酸，经软件预测无信号肽，理论分子量为132.09kDa，理论等电点为4.07。本专利技术的普鲁兰酶PulA的最适pH为9.0，在pH10.0时剩余77.4%的酶活。该普鲁兰酶在pH6.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在75%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。本专利技术的普鲁兰酶PulA的最适温度为50℃，在40-55℃时剩余50%以上的酶活。在不存在底物的情况下，该酶在45℃较稳定，处理一小时后剩余50%左右的酶活。该酶在50℃时的热稳定性不太好，处理一小时只剩余20%左右的酶活。本专利技术的普鲁兰酶PulA还具有很好的盐的耐受性和稳定性。在0.25–3.0MNaCl存在的情况下剩余55%以上的酶活。而且在0.25MNaCl存在的时候该酶的活性得到促进，活力为对照的105%。此外，该酶在3M和4MNaCl的浓度下处理60min,均剩余95%以上的酶活，表明该酶具有很好的盐耐受性。本专利技术还提供了编码上述碱性耐盐普鲁兰酶PulA的基因，该基因的碱基序列如如SEQIDNO.2所示。本专利技术通过PCR的方法分离克隆了这一普鲁兰酶基因PulA,DNA全序列分析结果表明，普鲁兰酶PulA结构基因PulA全长3555bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，GC含量50%，编码1184个氨基酸组成的多肽(PulA)，无信号肽序列，N端为一个第41家族的碳水化合物结合结构域（CBM），C端为一个普鲁兰酶的催化结构域。在GenBank中的比对结果表明它与Alkalibacteriumpelagium(SEK70797)的预测的普鲁兰酶最高一致性为93%，而且数据库中与它相似性大于50%以上的普鲁兰酶基因均未做过性质研究，表明PulA是一个新的普鲁兰酶。本专利技术还提供了包含上述碱性耐盐普鲁兰酶基因PulA的重组载体，优选为pET22b-PulA。将本专利技术的普鲁兰酶基因PulA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将普鲁兰酶基因PulA插入到质粒pET22b(+)上的NcoI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET22b-PulA。本专利技术还提供了包含上述碱性耐盐普鲁兰酶基因PulA的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/PulA。本专利技术还提供了一种制备碱性耐盐普鲁兰酶PulA的方法，包括以下步骤：1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2）培养重组菌株，诱导重组普鲁兰酶的表达；3）回收并纯化所表达的普鲁兰酶PulA。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/PulA。本专利技术还提供了上述碱性耐盐普鲁兰酶PulA的应用。本专利技术提供了一种性质优良的、适合于在洗涤和食品工业中应用的新普鲁兰酶PulA。本专利技术所提供的普鲁兰酶PulA最适反应温度为50℃，该酶的最适pH为9.0，在pH10.0的时候剩余77.4%的酶活。该普鲁兰酶还具有很好的pH耐受性，在pH6.0～11.0非常稳定。此外，该酶在0.25–3.0MNaCl存在的情况下剩余50%以上的酶活，且在3M和4MNaCl的浓度下非常稳定。本专利技术的普鲁兰酶PulA具有碱性耐盐的特点，因此本专利技术的碱性耐盐普鲁兰酶PulA可在洗涤剂工业中使用，增强去污能力。此外，该酶还可以应用于食品工业。附图说明图1：在大肠杆菌中表达的重组普鲁兰酶PulA的SDS-PAGE分析。其中，1：低分子量蛋白质Marker；2：未诱导的含有普鲁兰酶基因载体pET-PulA的大肠杆菌培养上清液；3：诱导的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

【技术特征摘要】
1.一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的碱性耐盐普鲁兰酶PulA的碱性耐盐普鲁兰酶基因PulA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含权利要求2所述碱性耐盐普鲁兰酶基因PulA的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组载体pET22b-PulA。5.包含权利要求2所述碱性耐盐普鲁...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国增，林娟，叶秀云，吴晶晶，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35