一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是新城疫Lasota病毒株,保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、由法氏囊VP2蛋白和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α‑干扰素蛋白。本发明专利技术将新城疫Lasota病毒株、H9亚型禽流感病毒QDY株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白、和鸡α‑干扰素蛋白抗原液按比例混合后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明专利技术制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

A quadruple vaccine for Newcastle disease, avian influenza, bursa of Fabricius and avian adenovirus

The present invention provides a kind of Newcastle disease, avian flu, and bursa of avian adenovirus vaccine, including antigen and vaccine adjuvant, which is antigen of Newcastle disease virus Lasota strain, the preservation number of H9 subtype avian influenza virus strains, CCTCC NO:V201517 by IBDV VP2 protein and amino acid sequence of avian adenovirus Hexon protein and chicken alpha interferon protein SEQ ID NO:2. The invention of Newcastle disease virus strain Lasota and H9 subtype of avian influenza virus QDY strain of IBDV VP2 protein, avian adenovirus Hexon protein, and chicken alpha interferon protein antigen liquid according to the proportion of mixed gas, mixed emulsion adjuvant vaccines. The vaccine prepared by the invention can improve the antibody level after immunization, improve the uniformity of the antibody after immunization, and ensure the immune effect of the vaccine. The vaccine has the advantages of high efficiency and good safety.

【技术实现步骤摘要】
一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗。
技术介绍
新城疫是新城疫病毒引起的禽类一种以呼吸道、消化道黏膜出血为特征的高度接触性、急性败血性传染病。同时感染其他病原如H9亚型禽流感，可引起的内源性感染，将会使产蛋鸡产蛋量下降，育成鸡死亡率增加，是危害我国养禽业的主要疫病之一。腺病毒科(Adenoviridae)根据形态结构、免疫学特性和宿主范围可划分为两个属:哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽腺病毒属(Avianadenovirus)。禽腺病毒是禽腺病毒属的代表种，由12个血清型病毒株组成，感染鸡可呈明显症状或不具有明显症状。与该病毒有关的主要临床和病理症候群包括肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量减少。Hexon蛋白是禽腺病毒主要结构蛋白，带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，与保护性免疫反应有关。禽腺病毒Hexon在病毒颗粒表面处于易接近的位置。该区域含有大量的保守性区域，具有较高的抗原性以及很好的暴露性并具有群特异性。随着我国禽业养殖规模的不断扩大，因禽腺病毒感染导致的继发感染也日益严重，对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。现有的禽腺病毒疫苗均为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，具有独特的优势如免疫后抗体均一，抗体效价也较高，但目前制造疫苗使用的毒株与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影响了攻毒保护效果，制约灭活疫苗的应用。使用全病毒抗原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免疫产生，干扰疫情的监测。这是目前传统疫苗存在的不足。为解决传统疫苗的问题，就需要开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别混合感染能够提高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。鸡传染性法氏囊病是由病毒引起的主要危害幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病，可引起严重的免疫抑制，其危害非常严重，造成较大的经济损失。本病的突出表现是鸡群突然发病，采食量锐减，死亡率增高。鸡群的饲养管理条件越差，发病年龄越小，或伴发有其他疾病，如新城疫、禽流感等，死亡率就越高。本专利技术一种新型的新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，有利于相关疾病的防制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CCTCCNO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、新城疫Lasota病毒株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白；保藏编号为CCTCCNO:V201517的H9亚型禽流感病毒株，为H9亚型禽流感病毒QDY株(Avianinfluenzavirus)，已于2015年4月29日保藏于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心。所述的禽腺病毒Hexon蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白，2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白；编码上述禽腺病毒Hexon蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:2，作为优选，编码上述禽腺病毒Hexon蛋白的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。所述的禽腺病毒Hexon蛋白由保藏编号为CCTCCM2017069菌株X33-H表达生产；保藏编号为CCTCCNO:M2017069的巴斯德毕赤酵母X33-H(PichiapastorisX33-H)，已于2017年2月27日保藏在位于中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心。上述疫苗中的H9亚型禽流感病毒、新城疫Lasota病毒、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白经过甲醛溶液灭活；上述的疫苗中新城疫病毒的含量不低于105.0EID50/0.4ml；H9亚型禽流感病毒的含量不低于104.0EID50/0.4ml；法氏囊VP2蛋白琼扩效价不低于1:32/0.4ml、禽腺病毒Hexon蛋白的含量不低于50μg/0.4ml和鸡α-干扰素蛋白的效价为103.0单位/0.4ml。本专利技术将新城疫病毒Lasota株、H9亚型禽流感病毒QDY株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白液按比例混合后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本专利技术制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。具体实施方式附图说明图1：本专利技术突变后Hexon蛋白的氨基酸序列比对图；图2：本专利技术实施例重组菌株X33-H的PCR鉴定图；图3：本专利技术实施例重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细的说明。实施例1：Hexon基因的扩增及序列分析自2010年以来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现了一种以死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、心包积水为特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群C-4型禽腺病毒引起的心包积水肝炎综合征。经调查，确信上述的发病鸡群之前已经注射过禽腺病毒疫苗，也做过中和抗体的检测。怀疑有禽腺病毒在疫苗的选择压力下发生了突变，从发病死鸡肝脏中成功分离出病毒，作为扩增的模板。1、扩增禽腺病毒Hexon基因根据NCBI中发表的Hexon基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：primer1：5′-ATGACTGCTCTTACTCCAGATTTGAC-3′；primer2:5′-AACAGCTTGGTTTCTCAAAGCAAAG-3′。提取分离的病毒的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定，结果核苷酸序列为SEQIDNO:1。与NCBI中已公布的禽腺病毒的HEXON基因进行核苷酸序列比对分析，结果同源性约为99％；推导的氨基酸第7位(D变V)、37位(I变F)、100位(D变A)、178位(V变E)、312位(V变L)发生变异，同源性分析约为98.6％(图1为YBAV-4株HEXON蛋白的氨基酸序列比对图)。结果表明，分离的病毒为新的禽腺病毒，含有新的Hexon基因。2、设计并合成禽腺病毒Hexon基因分析Hexon基因的抗原特性，根据毕赤酵母表达的密码子偏爱性，定点突变后，设计合成用于Hexon蛋白表达的核苷酸序列为SEQIDNO:3，送生物公司合成后为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-H。合成一对引物,引物的序列信息如下：primer3：5′-gggggtaccATGACTGCTCTTACTCCAG-3′；primer4:5′-gcggccgcTTGCAAAGTAGCAGTCTTG-3′。实施例2：Hexon蛋白的重组表达1.重组禽腺病毒Hexon蛋白的制备方法包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组Hexon蛋白的诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，其特征在于，所述的疫苗中包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、新城疫Lasota病毒株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α‑干扰素蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，其特征在于，所述的疫苗中包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CCTCCNO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、新城疫Lasota病毒株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白。2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白，2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。3.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2。4.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。5.如权利要求1或2所述的疫苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新文，王秀丽，胡潇，宫晓，陶晓珊，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37