一种基因VII型新城疫疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种基因VII型新城疫疫苗，其中使用的抗原为灭活的基因VII型新城疫病毒弱毒株WF株，其于2017年3月7日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201708。本发明专利技术通过自然筛选别获得的疫苗侯选株WF株作为抗原来制备疫苗，经疫苗免疫动物后发现，制备的疫苗能有效的诱导产生中和抗体，能抵抗强毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基因VII型新城疫疫苗
本专利技术属于疫苗制备
，具体涉及一种基因VII型新城疫疫苗。技术背景新城疫是由新城疫病毒引起的一种急性烈性传染病，对养禽业的危害极大，曾经被国际兽疫局(OIE)列为A类病。ND于1926年首先被发现于印度尼西亚爪哇，同年发现于英国的纽卡斯尔城，此后迅速向世界各地传播。目前ND已在世界范围内发生了四次大流行，并且宿主范围不断扩大。刘秀梵等对1985‐2003年分离自江苏浙江地区的29株新城疫病毒进行序列分析，结果显示有17株属于基因VII型，其中10株分离自发病鹅群。刘华雷等对2005年分离自中国大陆地区的83株新城疫病毒进行分析显示，其中64株属于基因VII型。Lien等对2003‐2006年间分离自台湾地区的20株新城疫病毒均为基因VII型。此外同阶段中国周边的韩国和日本流行的NDV也大都为基因VII型。我们对本实验室近年分离的部分NDV毒株也进行了测序分析，结果显示，70％以上的毒株为基因VII型。由此看出，基因VII型新城疫病毒在中国禽群中广泛流行，是目前的绝对优势基因型。当前市场上对新城疫病毒的防控主要使用IV系疫苗株Lasota、clone30和II系疫苗株B1等基因II型的毒株，它们虽然可以提供一定的免疫保护，但是不能完全阻止新城疫病毒的传播、扩散，特别是基因VII型新城疫病毒的流行给养殖业造成了巨大的经济损失。由于流行的基因VII型新城疫病毒都是强毒，因此大多数毒株不适合作为疫苗株使用，除非是自然弱毒株或是基因工程手段人工致弱的毒株。获得弱毒株是生产疫苗的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基因VII型新城疫疫苗，从而弥补现有技术的不足。本专利技术所提供的基因VII型新城疫疫苗，其中使用的抗原为灭活的基因VII型新城疫病毒弱毒株WF株，其于2017年3月7日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201708；所述的WF株的P蛋白的第237位和第240位氨基酸发生了突变，其中第237位为苏氨酸(T)，第240位为异亮氨酸(I)。所述的疫苗，其中WF株用甲醛进行了灭活。本专利技术通过自然筛选别获得的疫苗侯选株WF株作为抗原来制备疫苗，经疫苗免疫动物后发现，制备的疫苗能有效的诱导产生中和抗体，能抵抗强毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，具有广阔的应用前景。附图说明图1：新城疫F基因片段PCR鉴定图；图2：NDV毒株(WF株、SL株)基于F基因片段的系统发生树；图3：新城疫9个基因片段PCR鉴定结果图；图4：全基因组分段构建PCR鉴定结果图；图5：NP、P、L辅助质粒酶切鉴定图。具体实施方式本专利技术通过对临床分离的两株基因VII型NDV进行研究，发现一株为中等偏弱毒力毒株(WF株)，一株为强毒株(SL株)；通过对它们的基因组测序，并与NCBI公布的基因VII型NDV的P基因进行大量比对，发现WF株在P蛋白的第237位和第240位氨基酸与其它毒株不同，推测其可能与新城疫的毒力有关。按照WF株的P蛋白的序列对SL株的P基因进行改造，结果获得了一株高度致弱的基因VII型新城疫疫苗侯选株。分别研究WF株和改造后的SL株的生物学特性，并分别做成灭活苗免疫动物后，能提供很好的免疫保护效果；从而促成了本专利技术。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1基因VII型NDV野毒株的筛选及序列分析从临床发病鸡中分离到两株疑似NDV毒株，接种鸡胚收取尿囊液，测定HA效价。根据NCBI公布的NDV的F基因序列设计引物，鉴定新城疫毒株。上游引物：NDVF‐F：ATGGGCTCCAAACCTTCTACCAG；下游引物：NDVF‐R：AAACTGCTGCATCTTCCCAACCG。取收取的尿囊液250uL按常规方法提取RNA，反转录。以NDVF‐F/NDVF‐R为引物扩增F基因的部分片段，片段大小约500bp。核酸电泳后，切取阳性条带，回收，连接T载体测序。取F基因47nt‐420nt之间的序列绘制基因进化树，分析分离毒株的基因型。用于试验分析的毒株GenBank登录号为：1‐2(AY935499)、1‐2(AY935500)、18719‐03(GQ288385)、B1(NC_002617)、HB92(AY225110)、Herts(AY741404)、Italien(EU293914)、JS‐07(FJ766527)、Lasota(AF077761)、NA‐1(DQ659677)、paramyxovirus‐1(AJ880277)、ZJ1(AF431744)、Mukteswar(EF201805)。结果显示，两株分离毒株为新城疫病毒，F基因裂解位点的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117，符合强毒株的特征，进一步的基因进化分析显示它们为基因VII型毒株。HA效价测定显示，两株病毒鸡胚尿囊液的效价分别稳定在29和27‐28。分离的NDV毒株分别命名为WF株和SL株。其中基因VII型新城疫病毒弱毒株WF株，其于2017年3月7日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201708。实施例2新城疫SL株和WF株MDT、ICPI的测定MDT是指最小致死量所能使鸡胚死亡的平均时间，MDT低于60h为强毒力NDV毒株；MDT值在60h‐90h之间为中等毒力毒株；MDT大于90h的为弱毒株。用无菌生理盐水将新鲜收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10‐6、10‐7、10‐8和10‐94个稀释度，分别接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚尿囊腔内注射0.1mL。每天上午和下午各照胚一次，记录每一鸡胚的死亡时间，连续观察7日。(结果见表1)MDT计算公式为：ICPI是指1日龄雏鸡脑内致病指数。取1日龄SPF雏鸡15只，各脑内注射10‐1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05mL。另取5只以同样方法注射相同剂量的无菌生理盐水各0.05mL作为对照。接种后，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡。观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0，发病为1，死亡为2)累计总分数。ICPI为累计总分除以正常、发病和死亡动物的累计总数的平均值(结果见表1)。表1：WF株和SL株MDT、ICPI的测定上述结果显示，SL株符合强毒株的特征，与F基因裂解位点的强毒株特性一致；而WF株的F基因裂解位点虽然也符合强毒株的特征，但表1结果表明WF株属于中等偏弱毒株，证明新城疫的毒力不仅仅与F蛋白有关，推测可能还与其它蛋白如P蛋白等有关。实施例3：新城疫WF株、SL株全基因组序列的测定为了确定是否p蛋白也产生了变异，根据NCBI公布的NDV基因序列，设计9对引物，相邻扩增片段之间有部分核酸序列相互重叠。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表2。表2扩增NDVSL株全基因组的引物序列常规方法提取病毒RNA，反转录，上述引物进行PCR扩增，连接PMD19‐T载体测序，测的的序列在NCBI网站比对，用Lasergene软件拼接，获得WF株和SL株全基因序列。结果显示，WF株和SL株基因组全长15192bp，与Lasota等毒株本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因VII型新城疫灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中使用的抗原为灭活的基因VII型新城疫病毒弱毒株，其保藏编号为CCTCC NO:V201708。

【技术特征摘要】
1.一种基因VII型新城疫灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中使用的抗原为灭活的基因VII型新城疫病毒弱毒株，其保藏编号为CCTCCNO:V201708。2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的弱毒株的P蛋白的第237位和第240位氨基酸发生了突变。3.如权利要求2所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的P蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明义，孙化露，金红岩，李思菲，于泽坤，毕云英，刘阳，单学强，栾志舫，马礼照，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37