一种高活性的硒代蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种高活性的硒代蛋白及其制备方法，所述高活性硒代蛋白分子中含有硒(Se)，并且每克所述高活性硒代蛋白分子中含有硒50～5000μg。本发明专利技术提供的高活性硒代蛋白的生物活性显著高于普通的蛋白。本发明专利技术还提供了一种简单、稳定的制备高活性硒蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性的硒代蛋白及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种高活性的硒代蛋白及其制备方法。
技术介绍
硒(Selenium,Se)是哺乳动物必需的微量元素之一，现代医学研究证明，硒对癌症、心脑血管疾病、克山病、大骨节病等疾病均有防治作用。现有的研究发现，直接利用无机硒盐补硒具有一定的毒性，通过食物链补硒是解决缺硒问题的重要途径，但天然食物中的硒含量普遍较低，因此本领域技术人员大多致力于开发富硒功能产品，以满足人体对硒的需要。在天然状态下，硒是通过硒蛋白(Selenoprotein)来发挥其生理功能的。天然存在的硒蛋白是一类特殊的蛋白质，蛋白中的硒以硒代半胱氨酸(selenocysteine,SeCys)的形式存在。SeCys大多位于蛋白的活性中心，对蛋白的结构和功能起重要的作用。天然存在的硒蛋白中，SeCys由一个特殊的密码子--位于开放读码框(ORF)内的UGA密码子来编码(在一般蛋白质中UGA作为终止密码子起作用)，在翻译的同时掺入到正在合成的多肽链中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高活性的硒代蛋白、其制备方法及其应用。根据本专利技术的硒代蛋白优选为非天然存在的硒代蛋白，即在天然状态下此类蛋白中一般不含有硒或硒代的氨基酸。在本专利技术的第一方面，提供了一种高活性硒代蛋白，所述高活性硒代蛋白中含有硒(Se)，所述硒代蛋白中的硒含量为5～5000μg/g。在另一优选例中，与所述高活性硒代蛋白对应的野生型(天然)蛋白中不含硒。在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白的生物活性与不含硒的野生型对应蛋白相比提高了20％以上，优选地提高了30％以上，更优选地提高了50％。在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白的稳定性与不含硒的野生型对应蛋白相比提高了20％以上，优选地提高了30％以上，更优选地提高了50％。在另一优选例中，所述硒代蛋白选自下组：硒代酶(如，SOD、重组天门冬酰胺酶)、硒代抗体或其活性片段(免疫球蛋白，如曲妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、尼妥株单抗)、硒代多肽抗原、硒代多肽类受体、硒代多肽类配体、多肽类药物(如重组人粒细胞刺激因子、重组干扰素)。在另一优选例中，所述硒代的酶包括：硒代超氧化物歧化酶、重组天门冬酰胺酶。在另一优选例中，所述硒代蛋白中的硒共价结合于所述硒代蛋白的氨基酸残基上。在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白中的一个或多个甲硫氨酸氨基酸残基、和/或一个或多个半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代，从而形成所述高活性硒代蛋白。在另一优选例中，每克所述高活性硒代蛋白中含有硒10～3000μg；优选地含有20～1000μg；更优选地含有100～800μg；最优选地含有300～600μg。在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白为硒代超氧化物歧化酶，所述硒代超氧化物歧化酶中包含硒代的氨基酸残基，所述硒代氨基酸残基中的硫(S)被硒取代，所述硒代的氨基酸残基选自下组的一个或两个：第24位的甲硫氨酸氨基酸残基和第141的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQIDNO.2。在另一优选例中，所述超氧化物歧化酶中，还包括选自下组的一个或多个硒代的氨基酸残基：第1位的甲硫氨酸氨基酸残基、第195位的甲硫氨酸氨基酸残基和第197的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQIDNO.2。本专利技术的第二方面，提供了一种制备高活性硒代蛋白的方法，所述方法包括步骤：(i)提供一表达所述蛋白的细胞；(ii)在含硒培养液中培养所述细胞，从而使所述细胞表达高活性硒代蛋白；和(iii)分离并纯化所述高活性硒代蛋白。在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白为本专利技术第一方面所述的高活性硒代蛋白。在另一优选例中，所述步骤(ii)的含硒培养液中的硒为无机硒，优选为亚硒酸和/或亚硒酸盐(如，亚硒酸钠)。在另一优选例中，所述细胞为原核细胞、或真核细胞。在另一优选例中，所述原核细胞包括：大肠杆菌、放线菌等。在另一优选例中，所述真核细胞包括：酵母细胞、动物细胞(如，CHO细胞)，植物细胞等。在另一优选例中，所述细胞为具有外源的所述蛋白的编码基因的基因工程细胞。在另一优选例中，所述方法的步骤(ii)中，含硒培养液中硒含量为约10μg/ml～500μg/ml；优选地为约20μg/ml～200μg/ml；更优选地为约50μg/ml～150μg/ml；最优选地为约80μg/ml～140μg/ml。在另一优选例中，所述步骤(1)包括步骤：(a)将外源的所述蛋白的编码基因导入宿主细胞中，从而获得表达所述蛋白的基因工程细胞；和(b)对步骤(a)获得的基因工程细胞进行耐硒的筛选和/或驯化。在另一优选例中，所述步骤(b)中，总计进行n轮(1≤n≤20)的筛选和驯化：其中，第1轮筛选和驯化：将表达所述蛋白的基因工程细胞在液体培养基中进行培养，所述液体培养基中硒浓度为C1，C1为约5μg/ml～20μg/ml；然后将菌液涂布于固体培养基上，培养获得单一菌落，所述固体培养基中硒浓度为C1'；C1'＝C1+X1，X1为约5μg/ml～20μg/ml；第2轮筛选和驯化：将第一轮筛选出的表达所述蛋白的基因工程细胞的单一菌落在液体培养基中进行培养，所述液体培养基中硒浓度为C2，C2＝C1'；然后将菌液涂布于固体培养基上，培养获得单一菌落，所述固体培养基中硒浓度为C2'；C2'＝C2+X2，X2为约5μg/ml～20μg/ml；……；第n轮筛选和驯化：将第n-1轮筛选出的表达SOD的基因工程细胞的单一菌落在液体培养基中进行培养，所述液体培养基中硒浓度为Cn，Cn＝C(n-1)'；然后将菌液涂布于固体培养基上，培养获得单一菌落，所述固体培养基中硒浓度为Cn'；Cn'＝Cn+Xn，Xn为约5μg/ml～20μg/ml；第n轮筛选和驯化培养出的单一菌落用作步骤(ii)的种子。在另一优选例中，所述方法的步骤(ii)中，含硒培养液中硒含量为Cn'。本专利技术的第三方面，提供了一种组合物，所述组合物中含有本专利技术第一方面所述的高活性硒代蛋白。在另一优选例中，所述组合物中还包括保护剂，优选地所述保护剂包括选自下组的一种或多种：脱脂奶粉、海藻糖、和L-半胱氨酸(或其盐)。在另一优选例中，所述组合物为试剂组合物、药物组合物、保健品组合物、食品组合物、饲料组合物或化妆品组合物。在另一优选例中，所述组合物为液体制剂、粉剂或片剂。本专利技术的第四方面，提供了本专利技术第一方面所述的高活性硒代蛋白、本专利技术第三方面所述的组合物的用途，用于制备试剂、食品、药物、或保健品。本专利技术的第五方面，提供了一种高活性超氧化物歧化酶(SOD)，所述高活性超氧化物歧化酶中包含一个或多个硒代的甲硫氨酸氨基酸残基和/或一个或多个硒代的半胱氨酸氨基酸残基，硒代的甲硫氨酸氨基酸残基和/或硒代的半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代。在另一优选例中，硒代的氨基酸残基选自下组的一个或两个：第24位的甲硫氨酸氨基酸残基和第141的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQIDNO.2。在另一优选例中，所述超氧化物歧化酶中，还包括选自下组的一个或多个硒代的氨基酸残基：第1位的甲硫氨酸氨基酸残基、第195位的甲硫氨酸氨基酸残基和第197的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQIDNO.2。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活性硒代蛋白，其特征在于，所述高活性硒代蛋白中含有硒(Se)，所述硒代蛋白中的硒含量为5～5000μg/g；优选地，所述高活性硒代蛋白的生物活性与不含硒的野生型对应蛋白相比提高了20％以上，更优选地提高了30％以上，最优选地提高了50％。

【技术特征摘要】
1.一种高活性硒代蛋白，其特征在于，所述高活性硒代蛋白中含有硒(Se)，所述硒代蛋白中的硒含量为5～5000μg/g；优选地，所述高活性硒代蛋白的生物活性与不含硒的野生型对应蛋白相比提高了20％以上，更优选地提高了30％以上，最优选地提高了50％。2.如权利要求1所述的高活性硒代蛋白，其特征在于，所述硒代蛋白选自下组：硒代酶(如，SOD)、硒代抗体或其活性片段、硒代多肽抗原、硒代多肽类受体、硒代多肽类配体、多肽类药物。3.如权利要求1所述的高活性硒代蛋白，其特征在于，所述硒代蛋白中的硒共价结合于所述硒代蛋白的氨基酸残基上；优选地，所述高活性硒代蛋白中的一个或多个甲硫氨酸氨基酸残基、和/或一个或多个半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代，从而形成所述高活性硒代蛋白。4.在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白为硒代超氧化物歧化酶，所述硒代超氧化物歧化酶中包含硒代的氨基酸残基，所述硒代氨基酸残基中的硫(S)被硒取代，所述硒代的氨基酸残基选自下组的一个或两个：第24位的甲硫氨酸氨基酸残基和第141的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQIDNO.2。5.一种制备高活性硒代蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈代杰，邵雷，陈长凤，谭俊，张骏梁，朱慧，
申请(专利权)人：江苏德禧生物科技有限公司，上海医药工业研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32