一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取与酶活力测定方法技术

本发明专利技术方法公开了一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取与酶活力测定方法，属于酶活力检测技术领域。该方法主要技术是从甜菊新鲜叶片中初步分离纯化SrKA13H酶并采用高效液相色谱法（HPLC）对该酶进行活力测定，具体包括如下步骤：（1）甜菊叶内SrKA13H酶的粗提；（2）甜菊SrKA13H酶液制备；（3）甜菊SrKA13H酶与底物贝壳杉烯酸（

Extraction and enzyme activity determination method of Stevia leaf SrKA13H enzyme

The invention discloses a method of Stevia leaf SrKA13H extraction of enzyme and enzyme activity determination method, which belongs to the technical field of enzyme activity detection. The main technical method is the preliminary separation and purification of enzyme and SrKA13H by HPLC from Stevia fresh leaves (HPLC) on the enzyme activity determination, and includes the following steps: (1) the crude extract of Stevia leaves SrKA13H enzyme; (2) SrKA13H enzyme preparation of Stevia; (3) Stevia SrKA13H enzyme with the substrate (kaurenic acid

【技术实现步骤摘要】
一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取与酶活力测定方法
本专利技术属于酶活力检测
，具体涉及一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取与酶活力测定方法，可用于甜菊叶片中SrKA13H酶活力的检测。
技术介绍
甜菊（SteviarebaudianaBertoni）作为新兴的天然高甜度低热量糖源植物，其种质资源研究和优良新品种培育对甜菊产业的发展十分重要。因为甜菊糖苷生物合成途径的研究已明确甜菊糖苷与內源赤霉素共享MEP途径，直至共同前体物质内根-贝壳杉烯酸（ent-kaurenoicacid,ent-KA）的合成。ent-KA在内根-贝壳杉烯酸氧化酶（ent-kaurenoicacidoxidase,KAO）的作用下参与赤霉素合成，而经内根-贝壳杉烯酸羟化酶（ent-kaurenoicacid13-hydroxylase,KA13H）合成的甜菊醇则是甜菊糖苷各种组分的苷元。因此，SrKA13H是甜菊糖苷生物合成过程中的关键酶，该酶的相关研究可为进一步了解甜菊糖苷的生物合成过程，以及通过提高甜菊叶中甜菊醇含量进而提高甜菊糖苷含量的甜菊育种等工作奠定基础。由于目前尚无甜菊叶中SrKA13H酶提取与活力检测的相关方法，为开展甜菊种质资源评价工作和加快优良新品种培育进程，本专利技术首次公开一种从新鲜甜菊叶片中初步分离纯化SrKA13H酶，并根据该酶的底物特异性分析其酶活力的HPLC检测法。
技术实现思路
技术问题本专利技术目的是要解决从新鲜甜菊叶片中提取SrKA13H酶，并进行其酶活力快速分析的技术问题，提供一种适用于甜菊SrKA13H酶分离和酶活力高效快速检测的方法。技术方案一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取方法，其特征在于步骤如下：1、甜菊叶内SrKA13H酶的粗提：采集甜菊植株中部新鲜叶片，称取4g叶片，加液氮研磨粉碎后，加入20ml提取缓冲液震荡，4℃下11000r/min离心20min去除杂质，取上清液进行硫酸铵分级沉淀，离心后去除上清液，保存沉淀；所述提取缓冲液为，0.2M的磷酸钾缓冲液，pH7.8，含5mMMgCl2，2mMEDTA，20mM巯基乙醇，4g/L异抗坏血酸，20g/LPVPP；所述硫酸铵分级沉淀过程为，离心除杂后的上清液边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至50%饱和度，于4℃下11000r/min离心15min，去除沉淀，再次边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至60%饱和度，于4℃11000r/min离心15min，去上清液，保存沉淀；2、甜菊SrKA13H酶液制备：将步骤（1）中所得沉淀加入4g溶解缓冲液重新悬浮制备甜菊SrKA13H酶液，短期内不用需-80℃储存；所述溶解缓冲液为，0.2M的磷酸钾缓冲液，pH7.8；所述的甜菊叶内SrKA13H酶的酶活力测定方法，其特征在于，将步骤（2）中制得的甜菊SrKA13H酶液加入反应体系中，升温启动酶促反应，待酶促反应结束后，利用高效液相色谱仪检测经酶促反应终止后产生的代谢产物，计算KAH酶活力；所述酶反应体系包括酶、反应底物、NADPH产生系统和反应缓冲液，所述酶为步骤（2）中所得酶液，加入反应体系中酶液的浓度为30~90μg/mL；反应底物为40μM内根贝壳杉烯酸（ent-KA）；NADPH产生系统为0.2mMNADPH，10mM巯基乙醇，40μL20%乙醇；反应缓冲液为50mMTris缓冲液，pH=7.8；所述酶促反应过程为，反应温度30±0.2℃，反应时间5~30min，反应后将离心管至于100℃水浴10min终止反应；所述利用高效液相色谱仪检测酶活力方法为，将反应终止后的反应液11000r/min下离心10min，取上清0.22μm膜过滤后用于检测，色谱条件：f)色谱柱：HypersilODS2，4.6mm×250mm，5μm；g)流动相：乙腈：10mmol/L磷酸缓冲液=32：68；h)柱温：常温；i)流速：0.8ml/min；j)进样体积：20μl；所述计算KAH酶活力的计算公式为：式中：X为SrKA13H酶的活力，单位为U/g；m1为底物ent-KA减少量，单位为μg；M为底物ent-KA相对分子质量；t为反应时间；m2为供试品取样量，单位为g；n为供试品稀释倍数。有益效果本专利技术首次针对甜菊叶片内SrKA13H酶的性质及其酶促反应底物特异性通过试验探索成功建立了从甜菊叶片内初步分离纯化SrKA13H酶，并采用高效液相色谱法检测该酶活力的方法，相比传统的比色法，该检测方法不受显色试剂灵敏度及其他杂质的影响，液相检测的准确度更高，可用于不同生长条件下、不同甜菊种质资源叶片内SrKA13H酶活力的分析，可为甜菊种质资源评价以及通过提高甜菊叶片中甜菊醇含量进而提高甜菊糖苷含量的新品种培育等工作奠定基础。附图说明图1：ent-KA经SrKA13H酶催化转化为甜菊醇。图2：SrKA13H酶反应的HPLC色谱图。图3：代谢底物的消耗量与悬浮液蛋白浓度的相关性。图4：SrKA13H酶活力与反应时间的相关性。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的阐述。实施例1本专利技术为一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取与HPLC测定其酶活力的方法，所用材料及试剂：乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙醇、MgCl2、EDTATris、ent-KA、PVPP、NADPH、硫酸铵粉末、巯基乙醇、异抗坏血酸。主要设备：高效液相色谱仪、恒温水浴锅、离心机、磁力搅拌机，其步骤如下：（1）甜菊叶内SrKA13H酶的粗提：于甜菊品种‘中山6号’现蕾期采集植株中部新鲜叶片，称取4g加液氮研磨粉碎，加入20ml0.2M的磷酸钾缓冲液（pH7.8，5mMMgCl2，2mMEDTA，20mM巯基乙醇，4g/L异抗坏血酸，20g/LPVPP）震荡3min混匀，4℃下11000r/min离心20min，取上清缓慢加入硫酸铵粉末至50%饱和度，于4℃下11000r/min离心15min，去除沉淀，再加硫酸铵粉末至浓度达到60%，于4℃11000r/min离心15min，去上清液，保存沉淀；（2）甜菊SrKA13H酶液制备：将步骤（1）中所得沉淀加入20ml0.2M的磷酸钾缓冲液重新悬浮，短期内不用需-80℃储存；（3）取2ml离心管，加入800μl反应缓冲液(pH=7.8，50mMTris)，100μl的NADPH产生系统（0.2mMNADPH，10mM巯基乙醇，40μMent-KA，40μL20%乙醇），再加入100μl步骤（2）中所得酶液，总反应体积为1ml。升温至30℃，启动酶促反应，反应时间为15min，反应结束将离心管至于100℃水浴10min以终止反应，11000r/min离心10min，并用0.22μm滤膜过滤上清液，用高效液相色谱仪进行检测，检测结果如图2所示，ent-KA于15min出峰，根据ent-KA减少量，进行酶活力的计算，得到‘中山6号’现蕾期SrKA13H酶活力为2.47U/g。实施例2按照实施例1中的方法，改变反应体系中SrKA13H酶液的加入量，使其酶液蛋白质终浓度分别为30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml，进行测试，计算SrKA13H酶活力。结合实例1中的试验数据，得到底物ent-KA的消耗与粗酶添加量的相关性，如图3，由图3可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取方法，其特征在于步骤如下：（1）甜菊叶内SrKA13H酶的粗提：采集甜菊植株中部新鲜叶片，称取4g叶片，加液氮研磨粉碎后，加入20ml提取缓冲液震荡，4℃下11000r/min离心20min去除杂质，取上清液进行硫酸铵分级沉淀，离心后去除上清液，保存沉淀；所述提取缓冲液为，0.2M的磷酸钾缓冲液，pH7.8，含5mM MgCl2，2mM EDTA，20mM 巯基乙醇，4g/L异抗坏血酸，20g/L PVPP；所述硫酸铵分级沉淀过程为，离心除杂后的上清液边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至50%饱和度，于4℃下11000r/min离心15min，去除沉淀，再次边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至60%饱和度，于4℃ 11000r/min离心15min，去上清液，保存沉淀；（2）甜菊SrKA13H酶液制备：将步骤（1）中所得沉淀加入20ml溶解缓冲液重新悬浮制备甜菊SrKA13H酶液，短期内不用需‑80℃储存；所述溶解缓冲液为，0.2M的磷酸钾缓冲液，pH7.8。

【技术特征摘要】
1.一种甜菊叶内SrKA13H酶的提取方法，其特征在于步骤如下：（1）甜菊叶内SrKA13H酶的粗提：采集甜菊植株中部新鲜叶片，称取4g叶片，加液氮研磨粉碎后，加入20ml提取缓冲液震荡，4℃下11000r/min离心20min去除杂质，取上清液进行硫酸铵分级沉淀，离心后去除上清液，保存沉淀；所述提取缓冲液为，0.2M的磷酸钾缓冲液，pH7.8，含5mMMgCl2，2mMEDTA，20mM巯基乙醇，4g/L异抗坏血酸，20g/LPVPP；所述硫酸铵分级沉淀过程为，离心除杂后的上清液边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至50%饱和度，于4℃下11000r/min离心15min，去除沉淀，再次边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至60%饱和度，于4℃11000r/min离心15min，去上清液，保存沉淀；（2）甜菊SrKA13H酶液制备：将步骤（1）中所得沉淀加入20ml溶解缓冲液重新悬浮制备甜菊SrKA13H酶液，短期内不用需-80℃储存；所述溶解缓冲液为，0.2M的磷酸钾缓冲液，pH7.8。2.权利要求1所述的甜菊叶内SrKA13H酶的酶活力测定方法，其特征在于，将权利要求1步骤（2）中制得的甜菊SrKA13H酶液加入反应体系中，升温启动酶促反应，待酶促反应结束后，利用高效液相色谱仪检测经酶促反应终止后产生的代谢产物，计算KAH酶活力；所述酶反应体系包括酶、反应底物、NADPH产生系统和反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永恒，陆堃，徐晓洋，张永侠，刘清泉，原海燕，黄苏珍，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32