一种以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法技术

本发明专利技术属医药化学技术领域，涉及药物筛选方法，具体涉及以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的虚拟筛选模型及体外测试模型的建立方法，本发明专利技术包括步骤：(1)组织蛋白酶D蛋白三维结构的获取、分析及处理；(2)小分子数据库的构建及处理；(3)计算机虚拟筛选系统的建立；(4)运用步骤(3)的计算机虚拟筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选；(5)ADME‑T的预测。本发明专利技术的组织蛋白酶D抑制剂的筛选方法最终筛出6个具有组织蛋白酶D抑制活性的苗头化合物，具有快速、经济、高效的优势，大大提高了效率，为寻找组织蛋白酶D小分子抑制剂提供了基础。应用该方法获得的具有组织蛋白酶D抑制活性的化合物，可进一步用于开发新型抗癌药物。

A screening method for small molecule inhibitors targeting cathepsin D

The invention belongs to the medicine chemical technology field, relates to drug screening methods, method of establishing particular virtual screening model and in vitro test model on cathepsin D into small molecular targeted inhibitors of the invention comprises the steps of: (1) acquisition, analysis and processing of the three-dimensional structure of cathepsin D protein; (2) construction and processing molecular database; (3) the establishment of virtual screening system; (4) using the step (3) computer virtual screening system of step (2) in small ligand library screening; (5) ADME T forecast. The screening method of cathepsin D inhibitors of this invention eventually screened 6 compounds with signs of cathepsin D inhibitory activity, which is rapid, efficient and economic advantages, improve efficiency, provide the basis for small molecule inhibitors of cathepsin D. The compounds with cathepsin D inhibitory activity obtained by this method can be further used for the development of new anticancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法
本专利技术属医药化学
，涉及药物筛选方法，具体涉及利用虚拟筛选技术结合体外生物活性评价进行药物筛选的方法，尤其涉及以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的虚拟筛选模型及体外测试模型的建立方法，应用该方法获得的具有组织蛋白酶D抑制活性的化合物，可进一步用于开发新型抗癌药物。
技术介绍
资料显示，恶性肿瘤已成为威胁人类的重大疾病。肿瘤化疗仍是目前治疗恶性肿瘤的主要手段；由于化学药物其毒副作用大，选择性差，易产生耐药等缺点，其临床应用开始受到了限制。因此，开发选择性好、活性高的抗肿瘤药物成为当前药物研发领域的重要任务。现有技术公开了组织蛋白酶D(cathepsinD)是天冬氨酸蛋白酶家族的主要成员，其几乎存在于所有的哺乳动物组织和细胞内。cathepsinD是一种溶酶体肽链内切酶，在正常情况下，以低浓度存在于细胞内，其作用是参与蛋白质和多肽的降解。研究显示，在恶性肿瘤细胞中，CathepsinD过表达并过度分泌至胞外，参与肿瘤细胞入侵、增殖扩散、转移和凋亡等过程，此外，它还参与阿尔兹海默症和动脉粥样硬化等疾病的病理过程。研究公开了CathepsinD由粗面体内质网合成，经过高尔基体、内涵体的蛋白质水解修饰成cathepsinD前体，到达溶酶体后，再经历几次蛋白水解加工成成熟的cathepsinD。有研究报道，许多恶性肿瘤细胞过度表达并分泌的cathepsinD前体可从正常通路中逃逸出来，分泌至细胞外，参与恶性肿瘤的浸润和转移，cathepsinD的转移潜能和催化活性相关；一小部分的分泌cathepsinD前体由甘露糖-6-磷酸受体(M-6-PR)通路介导内吞，大部分分泌的cathepsinD前体由细胞表面的未知受体识别，它们的相互作用激活了MAPK信号通路，引起癌促基因包括不同的细胞因子和NFKB2的差异表达，刺激肿瘤的生长和侵袭。研究还显示，CathepsinD前体不仅可通过自分泌促进癌细胞的增生、浸润和转移，还可通过旁分泌促进间质成纤维细胞的生长；CathepsinD前体与成纤维细胞的增生、存活、运动和侵袭能力显著相关。研究还显示，肿瘤的生长和浸润均有赖于新生血管的形成，癌细胞过度表达并分泌的cathepsinD前体通过刺激内皮细胞，或者在细胞外基质的酸性环境中，酶法激活cathepsinD前体形成cathepsinD，从而促进血管再生；肿瘤新生血管形成过程中会分泌大量的cathepsinD，这将对利用组织蛋白酶的表达水平来检测肿瘤的发展进程带来新的启示(如图1所示)。鉴于传统的药物筛选方法存在着成本大、周期长、成功率低的缺陷，近年来，随着计算机模拟及计算化学的发展，利用模拟技术进行药物筛选已经成为现实；因此，本申请的专利技术人拟基于分子对接技术，对cathepsinD靶点进行虚拟筛选，具体提供一种以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，本方法能为快速寻找发现cathepsinD为靶点的小分子抑制剂提供基础。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：首先通过计算机虚拟筛选技术建立虚拟筛选模型对商业化的化合物库进行筛选，然后对挑选的化合物进行体外酶水平和细胞活性评价，并进行分子模拟分析以及ADME-T预测，最终得到对cathepsinD具有抑制活性的小分子苗头化合物。具体的，本专利技术提供了一种快速筛选组织蛋白酶D小分子抑制剂的方法，其包括步骤：(1)组织蛋白酶D(cathepsinD)蛋白三维结构的获取、分析及处理；(2)构建及处理对接用小分子配体库；(3)构建计算机虚拟筛选系统；(4)运用步骤(3)的计算机虚拟筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选；最终筛出具有组织蛋白酶D抑制活性的苗头化合物；(5)生物活性测试ADME-T的预测。本专利技术方法步骤(1)中，在蛋白数据库(http://www.rcsb.org)中搜寻并获得组织蛋白酶D蛋白的三维结构(PDBcode：1LYB),该结构为组织蛋白酶D蛋白与其抑制剂PepstatinA的复合物；使用薛定谔软件包中maestro10.1(2015-01，version10.1,http://www.com)的Proteinpreparationwizard模块进行准备，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子、α-甘露糖、β-甘露糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺，然后在OPLS2005力场条件下对蛋白进行能量优化，最终晶体结构中重原子RMSD小于本专利技术方法步骤(2)中，建立对接用小分子配体库；小分子结构specs201510mg数据库中获取，并滤除分子量大于650Da和小于200Da的分子；然后使用薛定谔软件包中maestro10.1里的Ligprep模块对配体进行优化；本专利技术方法步骤(3)中，构建计算机虚拟筛选系统使用薛定谔软件以配体PepstatinA作为格点盒子的中心生成格点文件，盒子大小为生成虚拟筛选用的格点文件；本专利技术方法步骤(4)中，用步骤(3)的计算机虚拟筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选：将准备好的小分子配体与靶蛋白进行对接，首先选用薛定谔软件包中maestro10.1里Glide的HTVS(high-throughputvirtualscreening)模式进行初筛,并选取打分前10％的化合物用SP(standardprecision)模式进行复筛,然后根据打分选取前5％的化合物用XP(extraprecision)模式进行精筛，最后根据打分、配体的结合构象、结构多样性对化合物进行挑选，并筛出具有cathepsinD抑制活性的苗头化合物：本专利技术方法步骤(5)中，根据虚拟筛选结果挑选化合物进行生物活性测试包括cathepsinD和该蛋白酶高表达的肿瘤细胞，最终筛选出具有CathepsinD抑制活性的化合物。本专利技术方法通过三轮筛选筛出6个具有CathepsinD抑制活性；所述化合物具有如下特征：化合物-1，英文名称：(E)-2-chloro-5-(5-((2,4-dioxo-3-(2-oxo-2-(p-tolylamino)ethyl)thiazolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoicacid化合物结构：化合物-2，英文名称:(E)-N'-(2-((3-methoxybenzyl)oxy)benzylidene)-2-((4-phenyl-5-(pyridin-4-yl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetohydrazide化合物结构：化合物-3，英文名称：(Z)-3-(4-(3-bromo-4-(2-((4-(ethoxycarbonyl)phenyl)amino)-2-oxoethoxy)-5-methoxybenzylidene)-3-methyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)benzoicacid化合物结构：化合物-4，英文名称：N-(2-((4-chlorobenzyl)oxy)benzyl)-1-(pyridin-2-yl)methanamine化合物结构：化合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，其包括步骤：(1)组织蛋白酶D三维结构的获取、分析及处理；(2)建立对接用小分子配体库；(3)计算机虚拟筛选系统的构建；(4)运用步骤(3)的计算机虚拟筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选；(5)生物活性测试。

【技术特征摘要】
1.一种以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，其包括步骤：(1)组织蛋白酶D三维结构的获取、分析及处理；(2)建立对接用小分子配体库；(3)计算机虚拟筛选系统的构建；(4)运用步骤(3)的计算机虚拟筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选；(5)生物活性测试。2.如权利要求1所述的以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在蛋白数据库(http://www.rcsb.org)中搜寻并获得组织蛋白酶D蛋白的三维结构(PDBcode：1LYB),该结构为组织蛋白酶D蛋白与其抑制剂PepstatinA的复合物；使用薛定谔软件包中maestro10.1(2015-01，version10.1,http://www.)的Proteinpreparationwizard模块进行准备，其中，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子、α-甘露糖、β-甘露糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺，然后在OPLS2005力场条件下对蛋白进行能量优化，最终晶体结构中重原子RMSD小于3.如权利要求1所述的以组织蛋白酶D为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)的建立对接用小分子配体库中；小分子结构specs201510mg数据库中获取，并滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，李英霞，高顶顶，包可婷，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31