人角蛋白KRT80基因及应用制造技术

本发明专利技术的目的在于针对KRT80基因的研究现状，阐明其在肺癌中的表达情况及作用。本发明专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：1.检测KRT80蛋白在临床肺癌中的表达情况；2.研制能特异性抑制KRT80基因的siRNA；3.利用Western blot检测KRT80蛋白的表达，验证2中siRNA的抑制效率，并筛选出能特异性抑制KRT80蛋白的siRNA序列；4.检测KRT80基因对肺癌细胞生物学功能的影响。

Human keratin KRT80 gene and its application

The aim of the present study is to clarify the expression of KRT80 gene in lung cancer and its role in the study. The purpose of the invention is realized through the following technical proposal: 1. the expression of KRT80 protein was detected in 2. lung cancer clinical research; can specifically inhibit siRNA gene KRT80; 3. used to detect the expression of KRT80 protein Western blot, 2 siRNA inhibition efficiency of verification, and screened the siRNA sequence specific inhibition of KRT80 protein the effect of 4.; the detection of KRT80 gene on the biological function of lung cancer cells.

【技术实现步骤摘要】
人角蛋白KRT80基因及应用
本专利技术属于分子生物学及肿瘤学领域，具体的，涉及到一种人角蛋白基因KRT80及其在肺癌中的表达和应用。
技术介绍
角蛋白是细胞骨架蛋白中的中间纤维蛋白，该家族蛋白是细胞骨架中间丝蛋白家族中最大、最复杂的一类。其中上皮角蛋白家族分为I型和II型角蛋白，II型角蛋白家族包括：K9-K28；II型角蛋白家族包括20个成员：K1-K8和K71-K80。上皮角蛋白广泛存在于上皮细胞，主要功能是参与组成上皮细胞中间纤维，对维持上皮细胞及组织稳定性和完整性具有重要功能。研究发现，一些角蛋白分子与恶性肿瘤密切相关，其异常表达可导致恶性肿瘤的发生。角蛋白K6、K8、K14、K16、K18的表达与皮肤鳞状上皮细胞癌和黑色素瘤相关，CK18是食管鳞状细胞癌患者预后的有效指标，K17和K19与口腔鳞状上皮细胞癌有关，K17低表达是早期疾病复发和疾病相关死亡的独立预后因子。KRT80又被称为KB20，其基因位于人染色体12q13.13，有K80和K80.1两个转录本，分别编码452和422个氨基酸，分子量约50.5KDa。KRT80是角蛋白家族的一员，在上皮细胞中普遍表达。然而，遗憾的是，目前关于KRT80基因相关功能的研究还未见报道，关于其蛋白表达情况以及在肿瘤等疾病中的作用及机制尚未见报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对KRT80基因的研究现状，阐明其在肺癌中的表达情况及作用。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：5.检测KRT80蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：(1)临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的176例I-IIIA期肺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性107例，女性69例；患者平均年龄57岁，年龄范围27至78岁。(2)上述标本经过苏木素-伊红(HE)染色后，进行病理诊断，以区分癌组织和癌旁组织。(3)免疫组化检测KRT80蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况。(4)利用SPSS软件统计分析KRT80蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异。6.研制能特异性抑制KRT80基因的siRNA，包括以下步骤：(1)利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人KRT80基因的转录本的编码(CDS)区(99-1457bp)信息，(NM_182507.2)CDS区具体序列如下。NM_182507.2：atggcctgccgctcctgcgtggttggcttcagcagcctcagcagctgtgaggtgaccccggtgggcagcccccggcctggaacctcaggatgggacagctgcagggcccccgggccgggcttcagctcccgcagcctcacaggctgctggtcggctggcactatctccaaggtgactgtgaaccccggcctgctggtgcccctggatgtcaagttggaccccgctgttcagcagctgaagaaccaggagaaggaggagatgaaggccctcaatgataaatttgcctccctaattggcaaggtgcaagccctggaacagcgcaaccagctgctggagacacgctggagcttcctgcagggccaggactcagccatcttcgacctcgggcatctctatgaggaatatcagggccggctgcaggaggaactgcgcaaagtgagccaggagcgggggcagctggaggccaacctgctgcaggtgctggagaaggttgaggagtttcgaatcaggtatgaggatgagatctccaagcgcacagacatggagttcacctttgttcagctgaagaaggacctggatgcagagtgtcttcatcggactgaactggaaaccaagttaaaaagcctggagagcttcgtggagttgatgaaaaccatctatgagcaggagctgaaggacctggcagcacaggtgaaggatgtgtcggtgaccgtcggcatggacagccgctgccacatcgacctgagcggcatcgtggaggaggtgaaggcccagtatgacgccgtcgcggctcgcagcctggaggaggccgaggcatactctcggagccagctggaggagcaggccgcccgctcggccgagtatgggagcagcctccagagcagccgcagcgagatcgcggatctcaatgtgcgcatccagaagctgcggtcccagatcctctctgtcaagagccattgcctgaaactggaggagaacatcaagacagctgaggagcagggtgagctggccttccaggatgccaagaccaagctggcccagctggaggccgccctgcagcaggccaagcaggacatggcgcggcagctgcgcaagtaccaggagctgatgaacgtcaagctggccctggacatcgagatcgccacctacaggaagctggtggagggcgaggagggcaggatggactcgccctcagccactgtggtcagcgctgtgcagtccaggtgcaaaaccgctgcctccagatcaggcctctccaaggccccctcccgaaagaagaagggcagcaaaggccccgtgatcaaaatcaccgaaatgtcagagaagtacttctcgcaggagtcggaggtctcagagtaa(2)根据siRNA序列设计原则，针对人KRT80基因的编码区，设计3个能特异性敲减人KRT80基因的小干扰RNA(siRNA)，核苷酸序列从左到右是5’-末端至3’-末端的方向，具体序列如下。(3)化学合成该siRNA。7.利用Westernblot检测KRT80蛋白的表达，验证2中siRNA的抑制效率，并筛选出能特异性抑制KRT80蛋白的siRNA序列，内参蛋白为α-Tubulin。8.检测KRT80基因对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：(1)细胞增殖活性检测(MTS法)：将103个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul培养基，置于5％CO237℃培养箱中培养1天后，每孔加MTS溶液(5mg/ml)30ul，继续孵育2小时；选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测4天。(2)流式细胞周期检测：将处于对数生长期的2×106个细胞于70％的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2M柠檬酸/柠檬酸钠高渗处理30分钟，1×PBS洗2次，0.1％Triton(PBS配制)洗1次，再用500μg/mlPI和0.1％RNAaseA，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。本专利技术的有益效果如下：1.本专利技术公开了KRT80蛋白在临床肺癌组织中高表达。2.用本专利技术研制的siRNA能特异性抑制肺癌细胞系中内源性KRT80的表达。3.MTS法检测细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制KRT80基因表达的小干扰RNA，其包括下述1)和2)中的至少一个双链RNA序列：1)正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正义链具有序列表中序列5的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列6的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抑制KRT80基因表达的小干扰RNA，其包括下述1)和2)中的至少一个双链RNA序列：1)正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正义链具有序列表中序列5的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列6的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于：所述小干扰RNA是一个正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列的双链RNA序列。3.根据权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于：所述小干扰RNA是一个正义链具有序列表中序列5的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列6的核苷酸序列的双链RNA序列。4.编码权利要求1-3任一项所述的抑制KRT80基因表达的小干扰RNA的基因。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述抑制KRT80基因表达的小干扰RNA的编码基因下述1)和2)中至少一个双链核苷酸序列：1)有义链具有序列表中序列1的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列或在高严谨条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋鑫，付桥粉，孟旭东，
申请(专利权)人：信雅生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32