对突变型多巴脱羧酶基因做剪接调整的反义寡核苷酸及其使用方法技术

一种对突变型多巴脱羧酶基因做剪接调整的反义寡核苷酸，其序列与SEQ ID NO：1互补，这种反义寡核苷酸能调整突变型的多巴脱羧酶基因的选择性剪接点，有助于研究发展治疗芳香族L‑氨基酸脱羧酶缺乏症的药物。本发明专利技术还揭露了上述反义寡核苷酸在体外细胞中的使用方法。

Antisense oligonucleotides for splicing of mutated dopa decarboxylase genes and methods for their use

An antisense oligonucleotide to adjust splicing mutant dopa decarboxylase gene, its complementary sequence and SEQ ID NO:1, the antisense oligonucleotide can adjust alternative splicing point dopa decarboxylase gene mutant, is helpful to the study of drug development for L aromatic amino acid decarboxylase deficiency. The present invention also discloses the use of the antisense oligonucleotides in the cells in vitro.

【技术实现步骤摘要】
对突变型多巴脱羧酶基因做剪接调整的反义寡核苷酸及其使用方法
本专利技术涉及一种反义寡核苷酸，尤其是涉及一种可调整突变型多巴脱羧酶基因序列剪接的反义寡核苷酸。
技术介绍
芳香族L-氨基酸脱羧酶(aromaticL-aminoaciddecarboxylase，简称AADC)为人类神经传导物质多巴氨(dopamine)及血清素(serotonin)的合成酶。AADC的关键基因为多巴脱羧酶基因(dopadecarboxylasegene，简称DDC基因)，具有15个表现子。AADC缺乏症属罕见隐性遗传疾病，专利技术人于2009年研究发现，中国台湾的AADC缺乏症主要为DDC基因介入子6的5端剪接位点下游第四个碱基(+4)由A突变为T，简称IVS6+4A＞T突变。IVS6+4A＞T突变继而使得DDC基因的pre-mRNA从一个错误的剪接点(+38crypticsplicesite)剪接，使得突变的DDC基因的mRNA在表现子6之后多插入37个碱基对的介入子6序列，因此，IVS6+4A＞T突变造成基因异常剪接。反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，简称ASO)是一种人工合成的单股DNA或RNA分子，长度约为13至45个碱基，可与互补的mRNA杂交而抑制该mRNA转译成蛋白质。此外，先前研究已报导过将不同型式的ASO送入细胞中能成功地调整基因剪接异常。发展针对DDC基因的异常剪接进行调整甚至修正的ASO有助于发展治疗AADC缺乏症的药物，而针对IVS6+4A＞T突变的DDC基因所设计的ASO对台湾AADC缺乏症的药物研发更是有助益。因此，本专利技术设计特定序列的ASO以调整IVS6+4A＞T突变的DDC基因的剪接位置。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于实现一种反义寡核苷酸，其可调整IVS6+4A＞T突变的多巴脱羧酶基因剪接。为实现上述目的，本专利技术揭露一种对突变型多巴脱羧酶基因做剪接调整的反义寡核苷酸，其序列与SEQIDNO：1互补。本专利技术中一优选实施例所揭露的反义寡核苷酸，其中该突变型多巴脱羧酶基因的突变型可为IVS6+4A＞T。本专利技术中一优选实施例所揭露的反义寡核苷酸，其可提升IVS6+4A＞T突变细胞内的血清素含量。本专利技术中一优选实施例所揭露的反义寡核苷酸，其可调整IVS6+4A＞T突变型多巴脱羧酶基因的剪接片段分布。本专利技术中一优选实施例所揭露的反义寡核苷酸，其可减少IVS6+4A＞T突变型多巴脱羧酶基因异常剪接片段。本专利技术中一优选实施例所揭露的反义寡核苷酸，其序列可为SEQIDNO：2-12或14中任一种。本专利技术的主要目的在于实现一种以反义寡核苷酸对IVS6+4A＞T突变的多巴脱羧酶基因剪接发生调整的方法。为实现上述目的，本专利技术揭露一种利用反义寡核苷酸调整体外IVS6+4A＞T突变细胞中的多巴脱羧酶基因剪接的方法，包含有以下步骤：加入如上述任一反义寡核苷酸至含有IVS6+4A＞T突变细胞的培养液中，培养72小时。如此，本专利技术所揭露的反义寡核苷酸及方法对IVS6+4A＞T突变的多巴脱羧酶基因剪接发生调整。有关本专利技术的详细特点，将在后续的详细说明中予以描述。然而，在本专利
中具有通常知识者应能了解，这些详细说明以及实施本专利技术所列举的特定实施例，仅用于说明本专利技术，并非用以限制本专利技术的专利申请保护范围。附图说明图1A为一代表的电泳胶照片，显示肇因于IVS6+4A＞T突变的AADC缺乏症病人(Pt)与正常人(Ct)的细胞中的mRNA片段，其中标出DDC基因的表现子5至8的间可能出现的剪接片段；图1B为图1A的量化结果；图1C示意DDC基因表现子5至8的选择性剪接模式(alternativesplicingpattern)；图2A显示ASO与DDC基因互补的位置；图2B为一代表的电泳胶照片，显示IVS6+4A＞T突变型细胞经ASO处理后的mRNA片段，其中标出DDC基因的表现子5至8的间可能出现的剪接片段；图2C为图2B的量化结果；图2D显示IVS6+4A＞T突变型细胞经ASO处理后，其细胞内的血清素的含量上升；图3A示意ASO与DDC基因互补的位置；图3B为一代表的电泳胶照片，显示IVS6+4A＞T突变型细胞经不同浓度的ASO处理后的mRNA片段，其中标出DDC基因的表现子5至8的位置；图3C为图3B的量化结果；图3D为一代表的电泳胶照片，显示IVS6+4A＞T突变型细胞经不同浓度的ASO处理后的mRNA片段，其中标出DDC基因的表现子5至8的位置；图3E为图3D的量化结果；图3F为一代表的电泳胶照片，显示IVS6+4A＞T突变型细胞经ASO处理后的mRNA片段，其中标出DDC基因的表现子5至表现子8的位置；图3G为图3F的量化结果；图4A为一代表的照片，显示IVS6+4A＞T突变型细胞经ASO处理后的蛋白质表现，其中标出信号识别颗粒蛋白30、40、55在西方墨点法转渍膜上的位置和强度；图4B为一代表的电泳胶照片，显示IVS6+4A＞T突变型细胞经ASO处理后的mRNA片段，其中标出DDC基因的表现子5至8的位置；图4C为图4B的量化结果；图5A为IVS6+4A＞T突变型细胞(Mut)与正常细胞(Ct)的DDC蛋白质表现；图5B为IVS6+4A＞T突变型细胞与经不同ASO处理后的DDC蛋白质表现；图6A为IVS6+4A＞T突变型细胞(Mut)与正常细胞(Ct)的血清素表现；图6B为IVS6+4A＞T突变型细胞经不同ASO处理后的血清素表现；图7A为本专利技术各式ASO对错误的剪接点(+38crypticsplicesite)的影响示意图；图7B为电脑预测会影响正常DDC基因选择性剪接模式的各种因子；图7C为电脑预测会影响IVS6+4A＞T突变型DDC基因选择性剪接模式的各种因子；图8为本专利技术以DDC基因的介入子6为互补目标所设计出的29个ASO序列；图9为本专利技术所揭露的所有ASO序列的位置图。具体实施方式为方便理解本专利技术，以下定义一些术语：核苷酸(nucleotide)：一单分子的去氧核醣核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)，其包含一五碳醣(pentose)、一磷酸根(phosphate)及一含氮杂环碱基(nitrogenousheterocyclicbase)。该碱基键结该五碳醣的第一个碳原子(1端碳)，且该碱基及五碳醣的组合是一核苷(nucleoside)。包含与该五碳醣的第三个碳原子(3端位置)与第五个碳原子(5端位置)键结的至少一个磷酸根的一核苷是一核苷酸。该五碳醣若为去氧核醣则称为去氧核醣核苷酸，该五碳醣若为核醣则称为核醣核苷酸。寡核苷酸(oligonucleotide)：包含两个以上的核苷酸，其中的一核苷酸的五碳醣的5端位置磷酸根与相邻的核苷酸的五碳醣的3端位置磷酸根相接合形成，其优选地超过三个，而通常超过十个，其确切长度取决于许多因素，其依次依照该寡核苷酸的最佳功能或用途而定。核酸(nucleicacid)：核苷酸的一聚合物，去氧核醣核苷酸聚合为去氧核醣核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)，核醣核苷酸聚合为核醣核酸(ribonucleicacid，RNA)。5端(5-prime，5’)：指相接合的核苷酸的五碳醣的第五个碳原子(5端位置)处缺少一核苷酸的一端，在该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对突变型多巴脱羧酶基因做剪接调整的反义寡核苷酸，其序列与SEQ ID NO：1互补。

【技术特征摘要】
2016.05.03 US 62/330,8941.一种对突变型多巴脱羧酶基因做剪接调整的反义寡核苷酸，其序列与SEQIDNO：1互补。2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中该突变型多巴脱羧酶基因的突变型为IVS6+4A＞T。3.如权利要求2所述的反义寡核苷酸，其可提升IVS6+4A＞T突变型细胞内的血清素含量。4.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，其序列为SEQIDNO：2。5.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，其序列为SEQIDNO：3。6.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，其序列为SEQIDNO：4。7.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，其序列为SEQIDNO：5。8.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，其序列为SEQIDNO：6。9.如权利要求2所述的反义寡核苷酸，其可调整IVS6+4A＞T突变型多巴脱羧酶基因的剪接片段分布。10.如权利要求9所述的反义寡核苷酸，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡启仁，迟景上，李秀芬，
申请(专利权)人：台中荣民总医院，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71